客戶案例｜輝瑞在多個實驗室同時部署MAM

引言

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Multi-Attribute Method(MAM)這一概念于2015年首見于發表文獻中1，由Richard Rogers等人共同提出，引起了生物制藥界的廣泛關注，在范圍內的學術會議/論壇中始終處于生物制藥策略相關對話的焦點位置。

作為一種基于肽圖分析的工作流程，得益于高效液相色譜-超高分辨質譜聯用平臺，MAM能夠同時提供多個產品質量屬性（product quality attributes, PQAs）的相對定量結果，兼具高分辨率、高質量精度與高靈敏度，使得復雜基質中的低含量修飾組分也可獲得高度可信的定量結果，從而幫助研究人員對PQAs更加深入的理解并優化生產工藝流程2。與此同時，系統良好的穩健性與重現性為跨實驗室部署MAM提供了可能。

客戶案例分享：

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建設面向未來的MAM實驗室

作為大的以研發為基礎的生物制藥公司，創新是改善健康狀況并保持輝瑞持續增長和收益的關鍵所在。輝瑞致力于為世界提供高品質的健康產品，并產出*利益相關者所期待的高品質結果。為支持公司的研究目標，質譜與生物物理表征組（Mass Spectrometry and Biophysical Characterization, MSBC group）的任務之一就是以開放、協作和及時的方式使用的表征策略、的儀器和創新的分析方法，闡明生物治療藥物的分子結構并終助力藥物的研發和商業化。因此，MAM工作流程進入了MSBC組的視野。

如前文所述，對于多個PQA，MAM工作流程能夠同時進行特定修飾位點的發現、鑒定、定量和監控。 與可能無法提供特定修飾位點信息的傳統檢驗方法相比，MAM可以直接為PQA提供定量評估結果，從而增強了研究人員對于過程和產品的理解。 對于輝瑞而言，他們的目標是在新產品開發伊始初的表征階段之后便通過MAM對各種樣品進行PQA監控、指導過程開發和結構功能研究，并終控制策略和規范設置。

因此，輝瑞公司成立了專門的團隊并實施了一個多站點MAM“未來實驗室”簡化PQA分析。

輝瑞的MAM歷程

輝瑞的MAM團隊在抗體藥物臨床前早期研發階段就會引入MAM工作流程，對未施加壓力條件/加速壓力條件的原料藥進行深度表征，對比所有預期/非預期的翻譯后修飾和化學修飾的變化?；谫惸w所提供的儀器和軟件平臺，MSBC組可以為每個產品建立全面的關鍵PQA工作列表，并轉移至后續的PPL生化/分離組（Project Progression Lines（PPL）biochemistry/separation science groups）用于PQA監控。因此，他們期望MAM能夠為PPL組提供額外的功能，以更廣泛的矩陣形式來監控具有位點特異性的多種屬性，同時作為潛在的、可信的放行/穩定性/鑒定和/或簡化工作流程以提高效率。

另外，輝瑞MAM團隊還將此工作流程用于與生產工藝改進和不同實驗室間變更相關的可比性研究實操。對于MSBC組和PPL生化/分離組而言，組內MAM的培訓和方法轉移是他們的短期目標。放眼長遠，儀器和軟件的日趨成熟與直觀性增強，對非質譜背景的操作人員更加友好，使得將MAM*整合至質量控制（quality control, QC）實驗室、制劑團隊和GMP 生產車間成為可能。

輝瑞將MAM引入分析過程中可以獲得的關鍵得益如下：

1、MAM是基于LC-MS平臺的一體化流程，可以同時對多個PQA進行分析，提供位點特異性的信息，可在日常分析中有效補充鑒定、放行和穩定性相關信息（圖2）。

2、MAM允許對已知PQA自動監控和定量，并且能夠對過程和產品開發中出現的新峰進行檢測，有助于建立針對產品特異性的、規章制度化的和整體的科學知識。

輝瑞對MAM的發展

如圖3所示，MAM包括數個必須要素。工作流程以快速酶解開始（通常使用胰酶），能夠保持樣品的翻譯后修飾（如N/O-糖基化修飾，唾液酸等），并大程度上減少酶解過程所引入的修飾（例如溫度/pH所導致的脫酰胺和氧化等）。MSBC組對產品進行深度表征，獲得位點特異性的PQA列表后，將該列表轉移至PPL組，隨后PPL組將此列表導入變色龍中，并使用LC-MS only的策略對PQA進行日常監控。色譜高度重現的保留時間、質譜的高分辨率/高質量精度以及同位素峰分布信息使得基于一級質譜信息來自動對庫中的PQA鑒定并定量成為可能。

圖3 輝瑞的MAM工作流程示意圖。MSBC 組進行初始的LC-MS/MS表征并確定位點特異性的PQA列表。隨后PPL組使用該列表，通過LC-MS方法進行PQA的日常監控。（點擊查看大圖）

在選擇PQA進行監控和定量時，如何將PQA數目控制在合理范圍內，以確保監控過程的快速與可信顯得尤為重要。因此，在實驗的初篩階段建立PQA列表時，可以先選擇一些廣為人知的PQA，例如N-糖基化、N-/C-末端修飾和其他常見修飾，如天冬酰胺脫酰胺、天冬氨酸異構化和甲硫氨酸/色氨酸氧化等，以監控可能的降解。隨著研究過程的深入，由于對產品有了更加全面的了解，可以將更多PQA添加至初篩得到的PQA列表中，從而保證對產品一致性的全面監控。得益于變色龍軟件的靈活性，PQA列表的實時更新非常容易實現。

系統的穩定性與重現性是保證MAM能夠獲得長期成功的關鍵要素之一。目前賽默飛*建議的系統穩定性評估是使用商品化的BSA酶解肽段標準品進行系統穩定性測試。與使用合成肽段標準品進行系統穩定性評估相比，雖然合成肽段標準品能夠對MAM的幾個關鍵要素，例如色譜保留時間、色譜峰型/峰寬，質譜質量精確度進行評估，除此之外BSA酶解肽段標準品還能提供額外的屬性用于監控，例如樣品前處理引入的化學修飾比例和源內裂解等。將BSA酶解肽段標準品作為系統穩定性測試的標準品，可以從儀器裝機開始便一直用同一套標準評判系統表現與穩定性。

輝瑞同樣也選擇了一個內部生產的單抗標準品用于MAM應用的日間穩定性監控。選用此標準品的意義在于，可以在BSA酶解肽段標準品的基礎上對酶解的穩健性進行評估。

來自于輝瑞的MAM實際應用案例

在近的一次網絡講座(Understanding Biotherapeutic Product Quality Attributes through a Multi-Attribute Method (MAM) Lab-of-the-Future, available on-demand)中，輝瑞MAM團隊*科學家Andrew Dawdy介紹了MAM工作流程的部分實際應用案例。

案例一

N-糖型定量：傳統2-AB標記法與MAM 的對比

在此案例中，研究團隊選擇了三批來自不同生物反應器的樣品，分別采用糖苷酶切除糖鏈，隨后使用2-AB標記并檢測的傳統方法，和MAM對N-糖肽進行相對定量結果進行對比。如圖4所示，對于主要/次要/痕量級糖型，MAM（藍色柱狀圖）與傳統方法（黑/灰色柱狀圖）的定量結果高度吻合。

圖4 MAM與傳統2-AB標記-HILIC-FLR法對來源于三個不同生物反應器樣品的N-糖型定量結果對比。兩種方法對主要/次要/痕量糖型的定量結果高度吻合。（點擊查看大圖）

案例二

通過MAM鑒定電荷變異體并精確定位至修飾位點

在強制降解研究中，將某單抗產品在40℃下孵育18周，隨后分別使用成像毛細管電泳（imaged capillary electrophoresis, iCE ）和MAM對其進行電荷變異體分析。兩種不同分析方法的結果高度相似。然而，iCE能夠提供的是全局層面的電荷變異體信息，意味著無法得到鑒定信息，或是將導致電荷異質性的因素細化到某一特定位點上；與此相反，對于每個酸性變異體相關的PQA，MAM均能提供全面的鑒定和位點特異性信息，從而幫助研究人員更好的理解每個位點的變化對于電荷異質性的貢獻（圖5）。除了能夠提供修飾位點的精確信息，MAM還能夠提供更加全面的信息。例如，傳統氧化分析方法只能提供Fc區一個目標位點的定量結果，而MAM可以同時提供多個位點/多種氧化修飾的定量結果。

圖5 使用MAM對電荷變異體進行精確到位點的鑒定與定量。（點擊查看大圖）

案例三

使用MAM研究制劑對于非酶解相關的賴氨酸糖化的影響

對于案例二中的強制加熱降解樣品，研究人員使用MAM評估了含蔗糖制劑和含海藻糖制劑對于賴氨酸糖化的影響。由圖6能夠看出，MAM可以提供精確至位點的賴氨酸糖化定量信息，可以明顯觀察到含蔗糖制劑的糖化比率遠遠高于含海藻糖制劑。與此同時，賴氨酸糖化的熱點也得到了鑒定。

圖6 使用MAM鑒定不同制劑中非酶解相關的賴氨酸糖化。由圖中可知，制劑一導致的賴氨酸糖化風險更高。（點擊查看大圖）

小結

● 通過與賽默飛的合作，輝瑞成功地在多個實驗室部署了MAM，用于生物治療產品的發展；

● 使用MAM，可以實現用一種方法同時對多個PQA進行直接分析，在對產品獲得更深入理解的同時也大大提高了效率；

● 輝瑞目前正在積極實施MAM開發項目以支持非GMP下的PQA監控，并對實際應用角度的、為研發后期所開發的MAM工作流程進行評估；

● 到目前為止，MAM的數據與一些傳統分析手段可以很好地吻合，對于幾個發展中的項目，MAM已可以針對特定PQA，實時或通過追溯當前和以前的數據集對比來提供關鍵信息，以幫助解決與結構/功能相關的關鍵問題；

● 輝瑞計劃在完成方法驗證以及必要的合規性和風險評估后的3-5年內，在QC實驗室實施MAM。

“One of the most important actions that have come from these meetings is Thermo Fisher Scientific’s readiness to incorporate changes in their software to make the method easier for the end user”

--Jason Rouse

制藥 

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