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T4 DNA Ligase催化雙鏈DNA或RNA中毗鄰的5'-磷酸基團和3'-羥基末端之間形成磷酸二酯鍵。酶還可以修復雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA復合體中的單鏈切口,連接DNA的粘性和平末端,但是該酶對單鏈核酸無酶活性。T4 DNA Ligase需要輔因子ATP。
特點- 快速–室溫下10分鐘內完成粘末端的連接反應。
- 該酶在Thermo Scientific限制性內切酶、PCR和RT緩沖液(添加ATP)中有活性。
- 配套提供聚乙二醇溶液,以高效進行平末端連接。
應用- 克隆酶切產生的DNA片段。
- 克隆PCR產物。
- 連接雙鏈寡聚核苷酸街頭或連接物。
- 定點誘變。
- 擴增片段長度多態性 (AFLP)。
- 連接酶介導的 RNA 檢測。
- 雙鏈DNA,RNA 或 DNA/RNA 復合體中缺口的修復。
- 線性DNA自身環化。
濃度1 Weiss u/µl = 200 CEU*/µl
5 Weiss u/µl = 1000 CEU*/µl
30 Weiss u/µl = 6000 CEU*/µl
* 一個粘性末端連接單位的是指在16°C 、30分鐘內50%連接HindIII酶切的lamda DNA產物所需要的酶的量。來源含有T4噬菌體克隆基因30的大腸桿菌。分子量55.3 kDa,單體。活性單位定義1個活性單位是指在ATP-PPi交換反應中,37°C、20分鐘內將1nmol [32PPi]轉換為Norit可吸收形式所需的酶量。1個Weiss單位相當于約200個粘性末端連接單位。酶活性分析混合物:66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.6 mM MgCl2, 0.066 mM ATP, 10 mM DTT, 3.3 micro Mol [32PPi]
保存緩沖液保存緩沖液組分:
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA和50% (v/v)甘油。10X T4 DNA Ligase 緩沖液(#B69)400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7.8, 25°C)。質量控制相關測試表明無內切和外切脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。 功能檢測:粘性末端或平末端DNA的連接能力。抑制與失活- 抑制劑:當反應體系中NaCl或KCl的濃度超過200??mM時,可強烈抑制T4 DNA Ligase活性。
- 失活:65°C加熱10分鐘或者70°C加熱5分鐘。
備注
- 聚乙二醇(PEG) 極大地增加平末端連接效率 (5) 。反應體系中的PEG 4000的建議濃度為5% (w/v)。
- T4 DNA Ligase與DNA結合會改變條帶的瓊脂糖凝膠電泳遷移率。為避免此現象,電泳前需處理樣本或分子量標準。樣本處理方法如下:樣本或分子量標準與Fermentas公司6X DNA Loading Dye & SDS溶液(#R1151)混合;70°C加熱5分鐘或65°C加熱10分鐘后冰浴保存。
- 轉化時,連接產物的體積不能超過感受態細胞體積的10%。
- 電轉化之前,先用氯仿抽提方法除去連接混合物中的T4 DNA Ligase。然后經乙醇沉淀純化抽提產物。
訂購信息:貨號 產品名稱 規格 EL0014 T4 DNA Ligase (5 Weiss U/µL) 200 U EL0011 T4 DNA Ligase (5 Weiss U/µL) 1,000 U EL0012 T4 DNA Ligase (5 Weiss U/µL) 5 x 1,000 U EL0013 T4 DNA Ligase, HC (30 U/µL) 5000 U EL0016 T4 DNA Ligase, LC (1 U/µL) 2x500 U
了解更多信息,/order/catalog/product/EL0011。
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