UltraRIPA 脂筏提取緩沖液套裝
- 公司名稱 富士膠片和光（廣州）貿(mào)易有限公司
- 品牌 其他品牌
- 型號(hào)
- 產(chǎn)地
- 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)廠家
- 更新時(shí)間 2020/9/14 15:25:29
- 訪問次數(shù) 1006
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| 供貨周期 | 一個(gè)月以上 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè) |
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UltraRIPA 脂筏提取緩沖液套裝
大幅度提升膜蛋白提取效率的新一代RIPA緩沖液
與常規(guī)的非變性細(xì)胞裂解緩沖液（RIPA buffer, 1% Triton X-100等）相比，這款緩沖液套裝（Buffer Kit）能迅速且高效地提取增溶相對(duì)困難的脂筏（Lipid Raft）蛋白質(zhì)。從常規(guī)緩沖液中不可溶而丟棄的膜組分中，在維持蛋白質(zhì)功能的情況下能實(shí)現(xiàn)高效地提取，有利于對(duì)脂筏等蛋白質(zhì)的功能分析。
※本產(chǎn)品僅限于研究用。不可用于臨床治療。
◆細(xì)胞膜上的不溶性成分——脂筏（Lipid Raft）
裂解細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)功能分析的時(shí)候，經(jīng)常會(huì)使用RIPA （Radio-Immuno Precipitation Assay）緩沖液和1% Triton X-100緩沖液等的相對(duì)溫和的細(xì)胞膜裂解緩沖液。這些緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)造和功能的影響小，適用于酶活性試驗(yàn)、免疫沉降和各種結(jié)合實(shí)驗(yàn)等蛋白質(zhì)的功能分析。另一方面，與具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性作用的SDS緩沖液相比，增溶能力較弱，*不能溶解以脂筏（Lipid Raft）為主的細(xì)胞膜組分。許多表面活性劑都不能溶解脂筏，故其又被稱為Detergent Resistant Membrane (DRM）。DRM中所含蛋白質(zhì)的功能分析被認(rèn)為是十分困難的。
脂筏（Lipid Raft）是由膽固醇（cholesterol）和鞘磷脂（sphingomyelin），GPI錨定蛋白（GPI anchor protein）和棕櫚酰化（palmitoylation）蛋白質(zhì)組成的細(xì)胞膜構(gòu)造，被認(rèn)為是整合各種功能蛋白的功能域。神經(jīng)細(xì)胞突觸和免疫細(xì)胞的免疫突觸是脂筏的代表性例子。
脂筏示意圖
◆特點(diǎn)
| ● | 操作簡單，能快速提取脂筏蛋白 |
| ● | 使用兩種類型的緩沖液（A buffer，B buffer）進(jìn)行兩個(gè)階段的提取。先提取出胞漿蛋白和非脂筏蛋白，然后提取脂筏蛋白 |
| ● | Buffer提取的任何蛋白質(zhì)都不會(huì)失活 |
| ● | A buffer和一般的RIPA buffer成分相同＊。B buffer含有表面活性劑，可以通過透析除去 |
| ● | 適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞/組織 |
| ● | 使用本品配制的溶解液適用于酶活性試驗(yàn)、免疫沉淀（Immunoprecipitation）、蛋白定量（BCA法）、SDS-PAGE和Western blot等 |
| ＊ | 1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl，0.5％ Sodium Deoxycholate |
◆緩沖液套裝組成
● A buffer (RIPA buffer) （100 mL）
● B buffer（10 mL）
◆使用方法
| 1、 | 用A buffer溶解組織或培養(yǎng)細(xì)胞。 |
| ※ | 為了提高溶解效率，推薦使用均質(zhì)或超聲波破碎設(shè)備。 |
| 2、 | 進(jìn)行離心分離，使A buffer中可溶性組分（上層清液）和不溶性組分（沉淀）分離，分別回收。上層清液A buffer可溶性組分中主要含有胞漿蛋白和非脂筏蛋白。 |
| 3、 | 往沉淀的A buffer 不溶性組分中加入B buffer，形成懸濁液。 |
| 4、 | 進(jìn)行離心分離，與步驟2一樣分離出可溶性組分（上層清液）和不溶性組分（沉淀），分別回收。上層清液的B buffer可溶性組分中含有脂筏蛋白。 |
| 5、 | 可應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)。 |
| ※ | A buffer和B buffer不可用于Bradford法蛋白質(zhì)定量。蛋白質(zhì)定量請(qǐng)使用BCA檢測。 |
| ※ | 使用本品A buffer和B buffer進(jìn)行兩個(gè)階段的提取是最適宜的，也有只對(duì)細(xì)胞使用B buffer進(jìn)行溶解和提取的例子。具體請(qǐng)參照以下例子。 |
UltraRIPA kit 、1% SDS buffer和RIPA buffer的比較
蛋白分離 | 蛋白結(jié)構(gòu) | 蛋白功能 | 應(yīng)用 | |||
胞質(zhì)蛋白 | 膜蛋白 | |||||
非脂筏蛋白 | 脂筏蛋白 | |||||
＞1%SDS buffer | ○ | ○ | ○ | ╳ | ╳ | SDS-PAGE |
RIPA buffer | ○ | ○ | ╳ | ○ | ○ | 酶分析法測定 免疫沉淀 SDS-PAGE等 |
UltraRIPA | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | |
◆應(yīng)用例
從脂筏中提取總蛋白
用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分（RIPA-insoluble fraction），添加2% SDS，RIPA buffer 和UltraRIPA kit B buffer進(jìn)行提取。提取后的總蛋白用SDS-PAGE/銀染色檢測（左），用BCA法定量蛋白質(zhì)（右）。相對(duì)于具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性作用的2% SDS緩沖液，UltraRIPA kit能夠提取70%以上的蛋白質(zhì)。
※不能保證全部蛋白質(zhì)的可溶性都得到改善。
脂筏標(biāo)記蛋白的提取
用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分（RIPA-insoluble fraction），添加2% SDS，RIPA buffer 和UltraRIPA kit B buffer，提取后進(jìn)行SDS-PAGE。利用對(duì)應(yīng)脂筏標(biāo)記蛋白的抗體進(jìn)行Western blot檢測。
脂筏標(biāo)記蛋白的免疫沉淀
用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分，通過B buffer提取脂筏標(biāo)記蛋白。對(duì) buffer提取物使用脂筏標(biāo)記蛋白PSD95的抗體和G蛋白偶聯(lián)磁珠進(jìn)行免疫沉淀。使用銀染色和抗PSD95抗體通過Western blot檢測進(jìn)行確認(rèn)。
提取的蛋白質(zhì)的酶活性測定
用1%TritonX100，RIPA buffer，UltraRIPA kit B buffer 和2%SDS溶解CHO細(xì)胞，測定溶解物中乳酸脫氫酶（LDH）的活性。2%SDS具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性作用，在幾乎*失活的情況下，1% Triton X100，UltraRIPA kit A buffer，和UltraRIPA kit B buffer所得的酶活性大致相同。
從脂筏中提取功能蛋白
用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全腦組織后，回收A buffer不溶性組分。用A buffer分三次沖洗不溶性組分，消除RIPA可溶性組分中脫磷酸酶的活性。往不溶性組分中分別添加2% SDS buffer，A buffer（RIPA buffer）和B buffer，測定各種提取物的總脫磷酸化酶活性。下圖是各緩沖液從RIPA不溶性組分中提取的蛋白質(zhì)的量（左軸：黑）和所檢測的脫磷酸酶的活性（右軸：紅）的示意圖。2% SDS buffer能夠從RIPA不溶性組分中很好地提取蛋白質(zhì)，但容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，*失去脫磷酸化活性。RIPA buffer不能提取蛋白質(zhì)，活性也無法檢測。UltraRIPA kit B buffer所提取的蛋白質(zhì)大約為2% SDS buffer的70%，且可以檢測出較強(qiáng)的脫磷酸化活性。
UltraRIPA kit B buffer單獨(dú)提取脂筏蛋白的可能性評(píng)價(jià)
※數(shù)據(jù)提供：東京大學(xué)藥學(xué)院研究生院保健化學(xué)系
用PBS沖洗COS-1細(xì)胞，分別使用SDS buffer，1% Triton X-100 buffer，UltraRIPA kit A buffer 和UltraRIPA kit B buffer裂解，通過離心分離（14,000 rpm, 5 min,4℃）可溶性組分和不可溶性組分。不可溶性組分用等量的SDS-PAGE樣品緩沖液變性溶解。脂筏標(biāo)記Flotilin1的可溶部分通過SDS-PAGE/western blot測定。使用1% Triton X-100和RIPA buffer，大部分的Flotilin 1不溶性膜組分沒有被溶解，而UltraRIPA kit B buffer幾乎可以全部溶解。
◆各buffer組成
| ● | SDS buffer（2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mMNaCl） |
| ● | UltraRIPA kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl， 0.5％ Sodium Deoxycholate) |
| ● | UltraRIPA kit B buffer (成分保密) |
| ● | 1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mMNaCl） |
◆產(chǎn)品列表
| 產(chǎn)品列表 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
| F015 | UltraRIPA 脂筏提取緩沖液套裝 | 1kit |
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