大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)
- 公司名稱(chēng) 安諾倫（北京）生物科技有限公司
- 品牌 其他品牌
- 型號(hào)
- 產(chǎn)地 北京
- 廠(chǎng)商性質(zhì) 代理商
- 更新時(shí)間 2020/5/12 14:47:38
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| 供貨周期 | 一個(gè)月以上 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè) |
|---|
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)介
1. 代謝途徑和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚
1) 全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開(kāi)放性閱讀框架；
2) 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善；
3) 繁殖迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，操作方便，遺傳穩(wěn)定。
2. 培養(yǎng)周期短
1) 大腸桿菌繁殖能力強(qiáng)，在營(yíng)養(yǎng)條件充足時(shí)，20~30mins即可繁殖一代；
2) 大規(guī)模發(fā)酵成本低，具有巨大的生存潛力。
3. 目標(biāo)基因表達(dá)水平高
表達(dá)水平較一般真核表達(dá)系統(tǒng)高，某些外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)量可達(dá)總蛋白的5%~30%。
4. 遺傳背景清楚
1) 對(duì)大腸桿菌的遺傳背景和生理特性研究相當(dāng)清楚，已有多種不同的抗藥性、不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型和不同校正突變型的菌株供選擇使用；
2) 可以根據(jù)不同的載體而選擇不同的菌株。
5. 抗污染能力強(qiáng)，下游工藝簡(jiǎn)單，易于控制。
6. 已有大量可供選擇利用的表達(dá)載體，被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體菌。
艾柏森生物大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)
1. 艾柏森生物大腸桿菌可溶性表達(dá)成功率高達(dá)95%；
2. 艾柏森生物可以提供多種大腸桿菌表達(dá)載體，pET28b、pET22b、pGEX-6P-1等。
3. 多種大腸桿菌表達(dá)宿主，標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)菌株BL21，可增強(qiáng)表達(dá)蛋白的菌株T7E，表達(dá)毒性蛋白的C41，增強(qiáng)蛋白可溶性表達(dá)的超低溫菌株Arctic，以及其他經(jīng)過(guò)艾柏森生物分子技術(shù)團(tuán)隊(duì)改造過(guò)的表達(dá)菌株，可以滿(mǎn)足客戶(hù)的不同需求。
4. 表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化。通過(guò)對(duì)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，很大程度上解決蛋白不表達(dá)和包涵體的問(wèn)題，如表達(dá)載體與表達(dá)菌株相容性測(cè)試、誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化、復(fù)性等。
服務(wù)組合
| 服務(wù)項(xiàng)目 (Service Items) | 周期（周） Time(weeks) |
| 蛋白分析與密碼子優(yōu)化 | 項(xiàng)目開(kāi)始前完成 |
| 基因合成 | 2~4 |
| 載體構(gòu)建 | 1 |
| 基因表達(dá)純化測(cè)試 | 2 |
| 1L發(fā)酵表達(dá)及純化 | 2 |
| 切標(biāo)簽 | 2 |
| 大規(guī)模的發(fā)酵與純化 | 以項(xiàng)目需要為準(zhǔn) |
| 總計(jì) | 8~10 |
注：
1）表達(dá)純化測(cè)試一般包括2種載體，3種表達(dá)菌株，2個(gè)表達(dá)溫度，12個(gè)條件的測(cè)試，根據(jù)客戶(hù)的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有可能調(diào)整或縮短試驗(yàn)周期；
2）我們可提供的備選優(yōu)化條件如下：
| 表達(dá)載體 | pET28bpET32apGEX-6p-1pET22bpBADpTrcHis等 |
| 表達(dá)菌株 | ArcticBL21(DE3)OrigamiRosettaT7 Expresss |
| 表達(dá)溫度 | 16℃30℃37℃ |
經(jīng)典案例
以某原核蛋白為例:
1. 優(yōu)化表達(dá)體系，包括蘇朱軍、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度及培養(yǎng)基。
| 宿主菌 | 誘導(dǎo)溫度 | 誘導(dǎo)時(shí)間 | 誘導(dǎo)劑 | 培養(yǎng)基 |
| T7E，BL21,C41,Arctic | 30℃/37℃ | 1h/4h | IPTG自誘導(dǎo) | LB/定制/同位素/自誘導(dǎo) |
經(jīng)過(guò)3輪優(yōu)化，我們選擇了BL21+pGEX-6p-1組合，并發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)與目標(biāo)蛋白的表達(dá)影響大，如圖一
圖一:融合蛋白小試SDS-PAGE分析圖
M:ProteinMarker；：誘導(dǎo)前總蛋白；
2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀。
2. 在確定了表達(dá)條件后，我們對(duì)蛋白進(jìn)行了GST瓊脂糖親和層析嘗試純化，如圖二，
圖二：GST瓊脂糖親和層析純化SDS-PAGE分析圖
M：Protein marker；S：上樣；F：流出；1：20mM GSH洗脫組分；
3. 在確定純化效率可以接受的條件下，我們對(duì)蛋白進(jìn)行了大體積發(fā)酵，并終純化SDS-PAGE分析，如圖三，融合蛋白經(jīng)過(guò)純化，SDS-PAGE電泳分析在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶，表明目的蛋白成功得到了純化。
圖三：蛋白終純化SDS-PAGE分析圖
M：Protein marker；1：目的蛋白
4. 蛋白濃度測(cè)定
采用SK3071 非干擾型蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度為1.06mg/mL，待測(cè)樣品體積為10μL，結(jié)果如下：
| 測(cè)試1 | 測(cè)試2 | 平均值 | BSA（μg） |
| 0.939 | 0.939 | 0.939 | 0 |
| 0.875 | 0.874 | 0.8745 | 8 |
| 0.808 | 0.804 | 0.806 | 16 |
| 0.74 | 0.746 | 0.743 | 24 |
| 0.618 | 0.616 | 0.617 | 40 |
| 0.855 | 0.849 | 0.852 | 50 |
| 0.891 | 0.878 | 0.8845 | 目的蛋白 |
圖四：蛋白濃度測(cè)定
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