mini-FIRe浮游植物熒光儀

在實(shí)驗室和海洋中構(gòu)建用于測量浮游植物生物量、生理學(xué)和光合作用的高級熒光系統(tǒng)

1.    研究目的和內(nèi)容

  研究目的

       該項目的目的是建造一種小型的臺式儀器，稱為F熒光I誘導(dǎo)和R馳預(yù)（mini-FIRe）系統(tǒng)，用于離散樣品分析和連續(xù)測量浮游植物在海洋中的豐度和生理狀況。與Rutgers團(tuán)隊發(fā)明和開發(fā)的前代FRRF和FIRe熒光儀不同，新儀器將表現(xiàn)出增強(qiáng)的靈敏度（約10倍），可實(shí)時提供更多生理參數(shù)。新儀器的高靈敏度使得它們對于在公海的實(shí)地工作有巨大價值。

研究內(nèi)容

       使用可變熒光技術(shù)對浮游植物和其他光合作用生物的光合作用活性的評估 - 光合作用生物的生理狀態(tài)的快速和無損評估依賴于使用快速重復(fù)率熒光學(xué) （FRRF） 及其技術(shù)后續(xù)熒光感應(yīng)和放松 （FIRE） 技術(shù)。這項技術(shù)是由Rutgers團(tuán)隊發(fā)明和開發(fā)的。評估光合作用生物生存能力的基本方法依賴于葉綠素"可變熒光"剖面的測量和分析，葉綠素是光合作用機(jī)構(gòu)*的特性（Falkowski等人于2005年對此進(jìn)行了審查）。"可變熒光"技術(shù)依賴于葉綠素?zé)晒馀c光合作用過程效率之間的關(guān)系，并提供了一套全面的熒光和光合作用參數(shù)的有機(jī)體。光學(xué)測量是靈敏的，快速的，無損的，可以實(shí)時和原位完成。

        這種方法和已實(shí)現(xiàn)的儀器學(xué)原理是在同行評審文獻(xiàn)中確立的（Falkowski and Kolber 1995; Kolber at al., 1998; Gorbunov et al., 2000, 2001; Gorbunov and Falkowski 2004）。最初是為研究水柱中的浮游植物而開發(fā)的，F(xiàn)RR技術(shù)提供了準(zhǔn)確的信息，說明浮游植物群落的運(yùn)作以及控制海洋初級生產(chǎn)力的環(huán)境因素的影響（e.g., Falkowski and Kolber 1995; Falkowski and Raven 2007; Behrenfeld et al., 1996; Coale et al, 2004; Falkowski et al, 2004）。使用臺式和潛水式FRR和FIRe熒光儀成為美國和世界上大多數(shù)生物海洋學(xué)項目不可分割的一部分。

       已開發(fā)出F熒光I誘導(dǎo)和R馳預(yù)（FIRe）技術(shù) ，以測量光合作用生物的一套全面的光合作用和生理特征（Gorbunov and Falkowski 2005）。 FIRe 技術(shù)基于對由一系列激發(fā)閃光引起的熒光瞬態(tài)的記錄和分析，這些閃光的強(qiáng)度、持續(xù)時間和間隔精確控制（圖 1 和 Gorbunov and Falkowski 2005）。 該技術(shù)提供了一套全面的參數(shù)，這些參數(shù)的特點(diǎn)是光合作用采光過程、光系統(tǒng) II （PSII） 中的光化學(xué)以及光合作用電子傳輸?shù)教脊潭āＳ捎谶@些過程對環(huán)境因素特別敏感，F(xiàn)IRe 技術(shù)為識別和診斷自然（營養(yǎng)限制、光化學(xué)和光刺激、熱應(yīng)力等）和人為應(yīng)激因素（如污染）提供了基礎(chǔ)。

圖1。FIRe 熒光瞬時的例子。熒光產(chǎn)量的動力學(xué)記錄為微秒時間分辨率，包括四個階段：（第一階段，100  ms）100 ms的強(qiáng)短脈沖（稱為單周轉(zhuǎn)閃光，STF）適用于累積飽和PSII，并測量從Fo到Fm（STF）的熒光感應(yīng)：（第二階段，500ms）弱調(diào)制光用于記錄500ms時間尺度上熒光產(chǎn)量的放松動能：（第三階段，50 ms）50ms 持續(xù)時間的強(qiáng)長脈沖（稱為多周轉(zhuǎn)閃光，MTF）用于飽和 PSII 和 PQ 庫：（第 4 階段，1 s） 弱調(diào)制光用于記錄 PQ 庫在 1s 的時間尺度內(nèi)再氧化的動力學(xué)。  第 1 階段的分析提供：最小和最大熒光產(chǎn)量（Fo，F(xiàn)m）；PSII光化學(xué)電荷分離的量子效率Fv/Fm（STF）；PSII 的功能橫截面，σPSII; 和連接因子（p）。第 2 階段為 PSII 接收方的電子傳輸提供時間常數(shù)（即Qa 受體側(cè)再氧化）。第 3 階段提供 Fm（MTF）和 Fv/Fm（MTF）。第 4 階段揭示了 PSII 和 PSI 之間的電子傳輸時間常數(shù)（PQ 庫的再氧化）。

       可變熒光技術(shù)的生物物理背景- 在室溫下，葉綠素?zé)晒庵饕a(chǎn)生于PSII。當(dāng)PSII反應(yīng)中心處于開放狀態(tài)（Qa氧化）時，熒光產(chǎn)量極小，F(xiàn)o。當(dāng) Qa 還原（例如，通過暴露在強(qiáng)光下）時，反應(yīng)中心關(guān)閉，熒光產(chǎn)量增加到其高水平 Fm。為了檢測Fo和Fm，F(xiàn)IRe技術(shù)記錄了由強(qiáng)烈的飽和脈沖光（~100 μs，稱為單周轉(zhuǎn)閃光，STF）引起的熒光感應(yīng)（圖1第1階段）。熒光感應(yīng)率與PSII的功能吸收橫截面成正比，而熒光上升的相對幅度Fv/Fm則由PSII光化學(xué)的量子效率來定義。熒光感應(yīng)的形狀由單個光合作用單元之間的激發(fā)量轉(zhuǎn)移控制，并由"連接因子"（Kolber et al. 1998）定義。因此，在沒有能量轉(zhuǎn)移（p = 0）的情況下，熒光感應(yīng)呈指數(shù)級，當(dāng)p 增加到 ~0.5 到 0.7 的最大值時，就會變成反曲線。

       PSII 受體側(cè)電子傳輸?shù)膭幽埽碤a再氧化）是通過 STF 之后的熒光馳預(yù)動力學(xué)分析（圖 1 第 2 階段）評估的。熒光動力學(xué)由幾個部分組成，因為Qa再氧化的速度取決于第二個電子受體Q b的狀態(tài)，Qb作為移動雙電子受體工作：

Qa- Qb  →  Qa Qb- (150 - 200 ms)                                (1)

Qa- Qb- →  Qa Qb= (600 - 800 ms)                                 (2)

Qa- _  →  Qa- Qb →  Qa Qb- (~ 2000 ms)                    (3)

       反應(yīng) （3） 與 Qb 最初脫離 D1 蛋白結(jié)合位點(diǎn)時的條件相對應(yīng)。此外，一小部分電子傳輸受損的失活反應(yīng)中心可能有助于馳預(yù)動力學(xué)中最慢的組件。FIRe 軟件使用 3 組件分析處理馳預(yù)動力學(xué)，以檢索電子傳輸?shù)臅r間常數(shù)（即 Q 氧化 tQa）。

       PSII 和 PSI 之間的電子傳輸?shù)臅r間常數(shù) tPSII-PSI 是從多周轉(zhuǎn)閃光（MTF，圖 1 中的第 3 階段和第 4 階段）之后的熒光馳預(yù)動力學(xué)分析中檢索到的。 在大多數(shù)生理條件下，這個時間常數(shù)是由質(zhì)體醌（PQ）庫再氧化的速度決定的，并且是一個數(shù)量級比tQa慢一個數(shù)量級。

       測量一系列環(huán)境光強(qiáng)的FIRe熒光參數(shù)，可以重建光合作用電子傳輸?shù)乃俾剩琍f，作為光強(qiáng)的函數(shù)（光合作用與光強(qiáng)曲線）（Kolber and Falkowski, 1993）。Pf 與光照產(chǎn)物和環(huán)境光下測量的光化學(xué)量子產(chǎn)量成正比（DF'/Fm'）。分析這些光合作用與光強(qiáng)曲線提供了光合作用最大電子傳遞速率（Pmax）和光飽和系數(shù)（Ek）。光合作用與輻射測量使用 FIRe 的光化光源 （ALS） 進(jìn)行，該光源通過 FIRe 數(shù)據(jù)采集軟件由計算機(jī)控制。

       研發(fā)背景和專業(yè)知識 – Rutgers團(tuán)隊的成員在可變熒光技術(shù)和方法的研發(fā)方面積累了超過 20 年的經(jīng)驗。他們發(fā)明并開發(fā)了10多項生物物理研究的*儀器（參見相關(guān)同行評審出版物的附錄參考清單），包括：  

● Pump-and-Probe Fluorometer (Kolber and Falkowski, 1986);

●  Pump-and-Probe LIDAR (Gorbunov et al. 1991);

● Fast Repetition Rate (FRR) Fluorometers (Kolber at al. 1993; 1998);

● Single-Celled FRR Fluorometer (Gorbunov et al. 1999);

●  Diver-operated FRR Fluorometer (Gorbunov et al. 2000);

●  Moorable FRR Fluorometer (Gorbunov et al. 2001);

● FIRe System (Gorbunov and Falkowski 2005);

● Diving-FIRe System (Gorbunov 2012);

●  Mini-FIRe System (Gorbunov 2013). 

2. 儀器介紹

       mini-FIRe基于與之前臺式FIRe儀器相同的生物物理原理（Gorbunov and Falkowski 2005），但新儀器更緊湊3倍，靈敏度提高10倍。葉綠素濃度的下限低至 ~0.005 mg/m3，這使得mini- FIRe對于在公海進(jìn)行現(xiàn)場采樣非常有價值。

       在這里，Rutgers團(tuán)隊提議建造一個mini-FIRe（圖2）該儀器將用于離散樣品分析（例如，從站點(diǎn)的尼斯金瓶收集的樣品）和/或在海洋中持續(xù)進(jìn)行取樣。儀器將配備一個流經(jīng)的樣品室，用于連續(xù)繪制浮游植物生物量和光合作用特性。以下是mini-FIRe記錄的生理參數(shù)列表和儀器技術(shù)規(guī)格mini-FIRe（圖2）。該儀器將用于離散樣品分析（例如，從站點(diǎn)的尼斯金瓶收集的樣品）和/或在海洋中持續(xù)進(jìn)行取樣。該儀器將配備一個流經(jīng)的樣品室，用于連續(xù)繪制浮游植物生物量和光合作用特性。以下是mini-FIRe記錄的生理參數(shù)列表和儀器技術(shù)規(guī)格。

圖2 mini-FIRe熒光儀，具有增強(qiáng)的靈敏度。

測量參數(shù)：

●暗適應(yīng)后最小和最大熒光產(chǎn)量（Fo， Fm）

●光適應(yīng)下有效、最小和最大熒光產(chǎn)量（F'， Fo'， Fm'） *

●光系統(tǒng)II、PSII 中光化學(xué)最大有效量子產(chǎn)量（Fv/Fm 和DF'/F m））

●三波長下功能性PSII吸收截面積（sPSII）

●光合作用單元之間的能量轉(zhuǎn)移效率（"連接因子"）

●PSII 受體側(cè)電子傳遞時間常數(shù)（Q a 到Qb，Qa 到 Qb-）

●PSII 和 PSI 之間的光合作用電子傳輸時間常數(shù)

●電子傳遞速率，ETR，作為光強(qiáng)的函數(shù) *

●光化學(xué)淬火系數(shù) （qP）和非光化學(xué)淬火系數(shù) （NPQ） *

●最大光合速率、初始斜率和光合作用周轉(zhuǎn)時間（從 F 與 E 曲線得到）

●這些參數(shù)是使用光化光源 （ALS） 測量，并記錄為光強(qiáng)曲線。

mini-FIRe 系統(tǒng)的技術(shù)規(guī)格：

●靈敏度：0.005 - 100 mg/m3葉綠素a（可通過添加中性密度減壓過濾器提高采樣濃度）

●激發(fā)光源：藍(lán)色（峰值波長450 nm，30 nm帶寬），綠色（峰值波長530 nm，40 nm帶寬），橙色（峰值波長590 nm，30 nm帶寬），用于選擇性激發(fā)不同功能組的浮游植物。

●發(fā)射檢測：680 nm（葉綠素a）和880 nm（細(xì)菌葉綠素a），其他波長可使用可更換的發(fā)射濾光片進(jìn)行選擇。

●尺寸： 10 x 5 x 12 英寸

References related to methodology

       Peer-Reviewed Publications:

Behrenfeld, M. J., A. J. Bale, Z. S. Kolber, J. Aiken, and P. G. Falkowski. 1996. Confirmation of iron limitation of phytoplankton photosynthesis in the equatorial Pacific Ocean. Nature 383: 508-511.

K.H. Coale, K.S. Johnson, F.P. Chavez, K.O. Buesseler, R.T.. Barber, M.A. Brzezinski, W.P. Cochlan, F.J. Millero, P.G. Falkowski, J.E. Bauer, R.H. Wanninkhof, R.M. Kudela, M.A. Altabet, B.E. Hales, T. Takahashi, M.R. Landry, R.R. Bidigare, X.Wang, Z.Chase., P.G. Strutton, G.E. Friederich, M.Y. Gorbunov, V.P. Lance, A.K. Hilting, M.R. Hiscock, M.Demerest, W.T. Hiscock, K.A. Sullivan, S.J. Tanner, R. M. Gordon, C.L. Hunter, V.A. Elrod, S.E. Fitzwater, S. Tozzi, M. Koblizek, A.E. Roberts, J. Herndon, J. Brewster, N. Ladizinsky, G. Smith, D. Cooper, D. Timothy, S.L. Brown, K.E. Selph, C.C. Sheridan, B.S. Twining, and Z.I. Johnson (2004) - Southern ocean iron enrichment experiment: Carbon cycling in high- and low-Si waters. – Science, 304 (5669): 408-414.

Falkowski PG, Koblizek M., Gorbunov M, and Kolber Z., (2004). Development and Application of Variable Chlorophyll Fluorescence Techniques in Marine Ecosystems. In: “Chlorophyll a Fluorescence: A signature of Photosynthesis” (Eds. C.Papageorgiou and Govingjee), Springer, pp. 757-778.

Falkowski, P.G., and Z. Kolber. (1995). Variations in the chlorophyll fluorescence yields in the phytoplankton in the world oceans. Aust. J. Plant Physiol. 22: 341–355.

Falkowski, P.G. and J.A. Raven. (2007). Aquatic Photosynthesis (2nd edition). Princeton University Press. Princeton, 484 pp.

Gorbunov M.Y., Fadeev V.V., and Chekalyuk A.M. (1991) Method of remote laser monitoring of photosynthesis efficiency in phytoplankton. - Moscow University Physics Bulletin. 46(6): 59?65.

Gorbunov M.Y., Kolber Z., and Falkowski P.G. (1999) Measuring photosynthetic parameters in individual algal cells by Fast Repetition Rate fluorometry. - Photosynthesis Research, 62(2-3): 141-153.

Gorbunov M.Y., Falkowski P.G. and Kolber Z. (2000) Measurement of photosynthetic parameters in benthic organisms in situ using a SCUBA-based fast repetition rate fluorometer. - Limnol. Oceanogr., 45(1):242-245.

Gorbunov M.Y., Z. Kolber, M.P. Lesser, and P.G. Falkowski P.G. (2001) Photosynthesis and photoprotection in symbiotic corals. - Limnol. Oceanogr., 46(1):75-85.

Gorbunov MY, and Falkowski PG. (2005). Fluorescence Induction and Relaxation (FIRe) Technique and Instrumentation for Monitoring Photosynthetic Processes and Primary Production in Aquatic Ecosystems.  In: “Photosynthesis: Fundamental Aspects to Global Perspectives” - Proc. 13th International Congress of Photosynthesis, Montreal, Aug.29 – Sept. 3, 2004. (Eds: A. van der Est and D. Bruce), Allen Press, V.2, pp. 1029-1031.

Kolber, Z., and Falkowski, P.G., (1993) Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ, Limnol. Oceanogr., 38, 1646-1665, 1993.

Kolber, Z., O. Prasil, and P.G. Falkowski (1998). Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols. Biochem. Biophys. Acta 1367: 88-106.

Lin H., Kuzminov F.I., Park J., Lee S.H., Falkowski P.G., and Gorbunov M.Y. (2016) The fate of photons absorbed by phytoplankton in the global ocean – Science, 351(6270), pp. 264-267. 

Park J., Bailleul B., Lin H., Kuzminov F.I., Yang E.J., Falkowski P.G., Lee S.H., and Gorbunov M.Y. (2017) Light availability rather than Fe controls the magnitude of massive phytoplankton bloom in the Amundsen Sea polynyas, Antarctica – Limnology and Oceanography, DOI: 10.1002/lno.10565.

Thamatrakoln K., Bailleul B., Brown C.M., Gorbunov M.Y., Kustka A.B., Frada M., Joliot P.A., Falkowski P.G., Bidle K.D. (2014) Death-specific protein in a marine diatom regulates photosynthetic responses to iron and light availability - Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol. 110, no. 50: 20123-20128. doi:10.1073/pnas.1304727110.