A549+luc人肺癌細胞+luc

Human lung cancer cells ,A549 luc

貨號：YJ-h011a（STR（A549鑒定））

價格： 3200.0

規格： 5*10 ⁵

細胞介紹

該細胞系由D.J.Griad通過肺癌組織移植培養建系，患者為58歲白人男性。A549能通過胞苷二磷酸膽堿途徑合成含有高含量不飽和脂肪酸的卵磷脂。

該細胞通過慢病毒轉染的方式攜帶Luc基因。

細胞特性

1） 來源：肺癌          

2） 形態：上皮細胞樣，多角形；貼壁生長

3） 含量：>1x10⁶ 細胞數        

4） 規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用

細胞篩選

該細胞為穩定轉染Luc的細胞，隨細胞傳代次數的增加，其Luc熒光強度會逐漸減弱。若實驗要求需要維持熒光強度，可以加入嘌呤霉素進行再次篩選。        

建議收到細胞后至少傳3代，凍存留種后再進行篩選。

初次進行細胞篩選時，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的*培養基維持培養，若無細胞漂浮或者漂浮較少，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的*培養基繼續篩選，以此類推，至最高藥物濃度為5ug/ml。若篩選過程中，漂浮細胞大于60%，則停止篩選，換成正常培養基培養，至細胞密度約80%，可繼續加入同濃度嘌呤霉素進行篩選。當加入5ug/ml嘌呤霉素時細胞正常增殖，可停止篩選，用不含藥*培養基正常培養。

細胞誘導構建實驗步驟：

1.  轉染 （1）將A549細胞接種6孔板，每孔細胞數約為1×10 5 個，

（2）第二天，細胞融合度為50%左右時用于病毒轉染，

（3）加入1mL*培養基，再加20 μL Luciferase過表達慢病毒，

（4）混勻后繼續培養，

（5）12h后觀察細胞狀態，并更換為新鮮培養基，

（6）當細胞長滿板底后，傳代至T25培養瓶中。

2.  篩選：用嘌呤霉素4ug/mL抗性篩選6周，穩轉細胞記作A549+Luc。

3. 體外熒光素酶活性檢測

取A549細胞消化，離心，棄上清，加20μL細胞裂解液，再加100μL熒光素酶底物，檢測發光情況。

結果表明慢病毒感染A549細胞能穩定表達熒光素酶。

運輸和保存

干冰運輸及復蘇好存活細胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。

（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。

3）貼壁細胞：細胞在37℃培養箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養瓶中灌液培養基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養瓶中）,加入新配制的*培養基6-8mL，放到細胞培養箱中繼續培養。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的*培養基來培養細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養瓶1：2傳代 。                      

一．細胞培養準備培養基及培養凍存條件準備：

1） 準備F-12K（推薦YJ-0007）培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二． 細胞處理：

1） 凍存細胞的復蘇：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL*培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，*培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml*培養基的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的*培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。

下面T25瓶為例；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。

注意事項

1.收到細胞后，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。

2.收到細胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養箱靜置2-4小時（視細胞密度而定）穩定細胞狀態。接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收細胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態，100*，200*各一張），觀察記錄細胞在運輸過程中是否有污染情況。作為我方進行銷售依據。

3.由于細胞狀態受環境、操作和運輸等多方面因素影響，故本公司只保證客戶收到細胞后一周內的細胞狀態，故客戶需要售后時需出示收到細胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發現問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。

4.所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

A549+luc人肺癌細胞+luc