NF-κB TWO-Luciferase Reporter HEK293 Cell Line 是一種設(shè)計用于監(jiān)測細胞活性以及 NF-κB（核因子 Kappa B）活性的 HEK293 細胞系。它包含一個由 NF-κB 響應(yīng)元件驅(qū)動的螢火蟲熒光素酶報告基因，該元件位于最小 TATA 啟動子上游的四個拷貝。此外，這種細胞系在 CMV 啟動子的控制下恒定表達 Renilla 熒光素酶，可用于確定細胞活性。這種細胞已經(jīng)通過 TNFα（腫瘤壞死因子α）和抑制劑 IKK-16 二ys鹽進行了驗證。

背景

核因子 Kappa B (NF-κB)/Rel 蛋白包括 NF-κB2 p52/p100、NF-κB1 p50/p105、c-Rel、RelA/p65 和 RelB。這些蛋白作為二聚體轉(zhuǎn)錄因子，控制調(diào)節(jié)包括先天和適應(yīng)性免疫、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)、B細胞發(fā)育和淋巴器官發(fā)生在內(nèi)的廣泛生物學(xué)過程的基因。它幾乎存在于所有哺乳動物細胞中，并對細胞應(yīng)激信號做出響應(yīng)，如應(yīng)激、自由基、紫外線輻射以及細菌和病毒。通過腫瘤壞死因子受體（TNFR）激活 NF-κB 是在與其相應(yīng)的配體 TNFα（腫瘤壞死因子α）結(jié)合時發(fā)生的。NF-κB 的激活增強了細胞炎癥并防止凋亡，這有助于腫瘤的發(fā)展。了解 NF-κB 通路及其調(diào)節(jié)方式對于理解健康和疾病中的基因調(diào)控至關(guān)重要。

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應(yīng)用

? 監(jiān)測 NF-kB 活性。

? 篩選 NF-kB 信號通路的激活劑或抑制劑。

? 并行研究化合物對 NF-kB 活性和細胞活性的影響。

細胞培養(yǎng)協(xié)議

注意：HEK293 細胞源自人類材料，因此建議采取適當(dāng)?shù)陌踩A(yù)防措施。

細胞解凍

1. 在 37°C 水浴中搖晃裝有冷凍細胞的小瓶大約 60 秒。細胞解凍后（可能比 60 秒稍快或稍慢），迅速將小瓶的全部內(nèi)容轉(zhuǎn)移到含有 10 ml 預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基 1 的試管中。

注意：在 37°C 的水浴中放置細胞過久會導(dǎo)致活性迅速喪失。

2. 立即以 300 x g 的速度離心細胞 5 分鐘，去除培養(yǎng)基并將細胞在 5 ml 預(yù)熱的解凍培養(yǎng)基 1 中重懸。

3. 將重懸的細胞轉(zhuǎn)移到 T25 或 T75 培養(yǎng)瓶中，并在 37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4. 培養(yǎng) 24 小時后，檢查細胞附著和活性。更換培養(yǎng)基為新鮮的解凍培養(yǎng)基 1，并繼續(xù)在 37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細胞準(zhǔn)備好傳代。

5. 細胞應(yīng)在W全融合前傳代。在S次傳代及后續(xù)傳代中，使用生長培養(yǎng)基 1G。

細胞傳代

1. 抽去培養(yǎng)基，用無 Ca2+/Mg2+ 的磷酸鹽緩沖液 (PBS) 沖洗細胞，并用 0.05% Y酶/EDTA 從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養(yǎng)基 1G 并轉(zhuǎn)移到試管中。以 300 x g 的速度離心細胞 5 分鐘，去除培養(yǎng)基并將細胞在生長培養(yǎng)基 1G 中重懸。

3. 按照每周 1:5 到 1:10 的期望亞培養(yǎng)比例，將細胞種入新的培養(yǎng)容器中。

細胞冷凍

1. 抽去培養(yǎng)基，用無 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 沖洗細胞，并用 0.05% Y酶/EDTA 從培養(yǎng)容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養(yǎng)基 1G 并計數(shù)細胞。

3. 以 300 x g 的速度離心細胞 5 分鐘，去除培養(yǎng)基并將細胞在 4°C 的細胞冷凍培養(yǎng)基 (BPS Bioscience #79796) 中重懸，細胞濃度約為 2 x 10^6 個細胞/ml。

4. 將 1 ml 的細胞懸浮液分裝到每個冷凍小瓶中。將小瓶放入保溫容器中緩慢冷卻，并在 -80°C 下保存過夜。

5. 次日將小瓶轉(zhuǎn)移到液氮中長期保存。

注意：建議在早期傳代時擴增細胞并至少冷凍 10 個小瓶以備將來使用。

圖 1. 在 hTNFα 存在下，NF-κB TWO-Luciferase Reporter HEK293 Cell Line 熒光素酶活性的細胞滴定曲線。

細胞在 96 孔板中以不同密度過夜培養(yǎng)，隨后在次日早晨用 hTNFα 處理。使用 TWO-Step Luciferase (Firefly & Renilla) 檢測系統(tǒng)測量了螢火蟲和 Renilla 熒光素酶活性。結(jié)果以背景減去的發(fā)光信號顯示。

文獻參考：

Chen W., et.al., 2011 Front. Biosci. 16: 1172-1185

Schmeck B., et.al., 2007 Eur. Respir. J. 29: 25-33

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NF-κB雙熒光素酶報告基因HEK293細胞系NF-κB雙熒光素酶報告基因HEK293細胞系