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奶酪的微波輔助氨基酸水解
檢測樣品：奶酪 奶制品
檢測項目：蛋白質 氨基酸
方案概述：Discover2.0系統可以作為更快速，更安全的監控替代方案貫穿奶酪的生產過程；提供更加深入的熟化，風味概況的監控。
奶酪的成熟涉及多種生化變化，例如脂肪水解、乳糖發酵和蛋白質降解。這些過程極大地影響了奶酪的質地、味道和香氣。更具體地說，氨基酸的含量和特性會影響整個老化過程的奶酪風味。食物中的氨基酸既是游離的未結合分子，也是通過肽鍵結合在一起的氨基酸殘基，從而產生乳制品中存在的各種蛋白質。為了全面評估奶酪在整個成熟過程中的氨基酸含量，需要對氨基酸組成進行準確評估。為此，必須水解蛋白質，有效地釋放氨基酸殘基，然后可以在水解產物中對其進行定量檢測。
傳統上，蛋白質在酸性或堿性條件下分別用 6 N HCl 或 4 N NaOH 在密封容器中 110 °C 處理18至24小時進行化學水解，時間、溫度和試劑等因素會影響水解反應的準確性和精密度，從而影響氨基酸定量。總之，氨基酸分析是一項昂貴、棘手且耗時的實驗室程序。通常，水解反應代表著這個過程的反應速度受到限制；減少有機反應的反應時間，另一種方法是用微波能代替常規加熱。與傳統的加熱方法相比，微波可以在更高的溫度和更短的反應時間內成功地促進蛋白質水解反應。CEM 的 Discover® 2.0 微 波反應器可以為實驗室提供工具，以高效、可重復和安全的方式。
材料與方法
試劑與樣品
所有試劑均購自商業供應商，水解溶液在使用前新鮮制備。從當地的商店收集奶酪樣品，在食品加工機中均質化，并在 4°C 下儲存直至分析。使用分析天平等分每個樣品的 300mg 部分，用于其扌旨定的水解反應。水解產物的氨基酸含量通過柱前衍生化，然后進行 UPLC 進樣和 260nm處的 PDA 檢測來確定。Waters AccQ-Tag™ Ultra Derivatization 試劑盒用于水解產物的 LC- PDA 分析。所有樣品一式三份進行分析。
傳統的氨基酸水解方法
在玻璃小瓶中加入 300mg 樣品，然后加入 2.5mL 含 3% (w/v) 苯酚溶液的 6 N HCl。然后用 N 2 吹掃反應瓶并迅速密封。重復此過程，直到所有樣品都準備好放入 110°C 烘箱中20小時。完成后，將樣品從烘箱中取出并在衍生前冷卻至室溫。
Discover 2.0 水解方法
反應設置：將 300mg 樣品部分添加到配備有攪拌棒的 35-mL Pyrex 容器中。然后向每個微波反應容器中加入體積為 5mL 的 6 N HCl w/3% 苯酚。
容器用 N2 吹掃5分鐘，用 Teflon® 內襯硅膠蓋快速密封，然后放置在自動進樣器架中，以便自動放置在 Discover 2.0 腔中。
方法編程：一步動態法，在 Discover2.0 系統中為奶酪的氨基酸水解編程。
使用以下的方法參數：
酸水解
容器類型：Pyrex
控制方式: Dynamic動態
溫度: 165 °C
時間：20-min
壓力: 300 PSI
功率: 300 W
攪拌: 高
分析樣品準備
所有水解產物溶液通過 0.2µm PTFE 過濾器并用 6 M NaOH 中和，為 AccQ-Tag 衍生化做準備。將來自 Waters AccQ-Tag Ultra Derivatization 試劑盒的 70µL 硼酸鹽緩沖液添加到新的回收瓶中。加入 10µL 中和樣品，將小瓶蓋上蓋子并渦旋。然后，將 20µL 從 試劑盒中制備的衍生化試劑添加到每個樣品反應中。將反應混合物渦旋10秒，然后在 55 °C 下加熱10分鐘，然后進行分析。
分析
將 5µL 體積的每個衍生反應注入與 Waters PDA 檢測 器相連的Waters Acquity H-Class UPLC。使用 Waters AccQ-Tag Ultra C18 色譜柱（1.7µm，2.1 x 100mm）以 0.25mL/min 的流速進行分離。柱溫為 45°C。洗脫梯度如表1所示。流動相為A：在 MilliQ 水中稀釋10倍的 Waters AccQ-Tag Eluent A 和 B：Waters AccQ-Tag Eluent B。為了確定每種氨基酸的氨基酸濃度，Waters Amino 酸標準（沃特世公司，部件號 WAT088122）是在 5、10、25、50 和 100pmol/µL 的濃度下衍生。
結果與討論
Discover 2.0 經評估可促進奶酪的酸輔助氨基酸水解。將結果與對相同樣品進行的傳統烘箱水解方法進行了比 較。表2重點介紹了在傳統水解烘箱條件以及 Discover 2.0 酸水解反應條件下切達干酪和科爾比干酪樣品的氨基酸回收率。所有 Discover 2.0 輔助水解反應在回收率方面都與傳統水解反應的對應物相比很好。
微波加熱提供快速、高效和可靠的整體加熱。這種介電加熱機制允許以均勻和瞬時的方式將熱量傳遞給反應內容物。傳統的加熱方法，例如烤箱和加熱罩，依賴于通過容器壁傳遞熱量，熱量然后再通過反應組分，這導致緩慢和低效的加熱以及不希望的溫度梯度和副反應。此外，在 Discover 2.0 水解反應過程中添加攪拌可提高反應均勻性。后，壓縮空氣可將微波輔助反應快速冷卻至安全處理溫度，從而縮短樣品分析時間。Discover 2.0 提供了一種氨基酸水解的替代途徑，具有關鍵優勢，包括更短的反應時間、更清潔的水解產物和更快的分析時間。
對兩種不同的奶酪樣品進行酸水解，然后對所得氨基酸進行衍生和表征，以確定完整的氨基酸譜。傳統加熱法與快速微波法的比較表明，在大多數情況下，微波氨基酸的回收率更高，反應時間更少。這些結果表明，Discover2.0 系統可以作為更快速，更安全的監控替代方案貫穿奶酪的生產過程；提供更加深入的熟化，風味概況的監控。
參考文獻
AccQ-Tag™ is a trademark of Waters Corporation. Teflon®isa registered trademark and a brand name owned by Chemours (formally DuPont).
Chen, S. T.; Chiou, S. H.; Chu, Y. H.; Wang, K. T. Int. J. Pept. Protein Res. 1987, 30, 572-576.
Davidson, I. Methods Mol. Biol. 2003, 211, 111-22.
Han, K.; Richard, C.; Biserte, G. Int. J. Biol. Chem. 1983, 15, 875-884.
Margolis, S. A.; Jassie, L.; Kingston, H. M. J. Automat. Chem. 1991, 13, 93-95.
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