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高通量自動化微波增強多肽合成
檢測樣品：多肽
檢測項目：多肽合成
方案概述：CEM的微波多肽合成儀可與HT自動樹脂裝載配合，允許用戶排列并自動連續合成多達24個多肽。對于隊列中的每個多肽，成批的單個樹脂被預加載到HT上，然后自動轉移到Liberty合成儀進行肽合成。
高通量自動化微波增強多肽合成
High-Throughput Automated Microwave-Enhanced Peptide Synthesis
簡介 將高通量自動化用于連續微波多肽固相合成（SPPS） 為多肽 生產提供了顯著優勢。 可以更高的純度、更少的浪費和極快 的速度每批次合成多達 24 種肽。 與平行方法相比，批次中的 單個肽可以方便地進行分析和純化，而無需等待整個批次完 成。 在 Liberty PRIME™ 2.0 HT24 上展示了自動連續微波 SPPS 的使用，可快速生產 20 種不同的 16 個氨基酸組成的 新生抗原肽。
介紹 現代肽研究是快節奏的，通常需要篩選肽庫以發現和開發功能 性多肽。 自動化的微波輔助 SPPS 大大減少了合成多肽所需 的時間，但如果需要準備文庫，則每次合成一個肽需要用戶在 每個合成之間輸入序列。 CEM 的微波多肽合成儀（Liberty™ 2.0、Liberty Blue™ 2.0 和 Liberty PRIME™ 2.0）可與 HT 自 動樹脂裝載配合，允許用戶排列并自動連續合成多達 24 個多 肽。 對于隊列中的每個多肽，成批的單個樹脂被預加載到 HT 上，然后自動轉移到 Liberty 合成儀進行肽合成。 自動樹脂轉移無需用戶在每個排隊的肽之間輸入，從而大限度 地提高工作日的生產力，并允許多個肽合成過夜運行。 HT 自動 樹脂裝載模塊設計用于根據合成器的循環時間，理想條件下能在 一個隊列中傳輸 4、12 或 24 批樹脂。 根據研究人員的需要， 快的合成器 Liberty PRIME 2.0 可以配備 HT4、HT12 或 HT24。 Liberty Blue 2.0 可配備 HT4 或 HT12，而基本型號 Liberty 2.0 可配備 HT4。 此外，Liberty PRIME 2.0 合成器配置 有HT24時， 可容納額外的試劑和試劑瓶，在無需重新填充的條 件下運行大批量合成，并且具有在 cGMP 標準下用于肽生產可選 配置。 為了證明，使用配置有HT24的 Liberty PRIME 2.0 合成了一組 20 種已發表的新抗原肽 1、2，它們具有不同的序列，平均長度為 16 個氨基酸殘基。 這組肽的總合成時間為 24 小時 14 分鐘。 使用 CarboMAX™ 以 0.1 mmol 規模合成肽，得到的粗肽純度為 47% – 90%，平均純度為 69%（第 2 頁的表 1 和第 3 頁的圖 1）3。總 DMF 的使用量為 6056 mL，產生的廢物總量為 6979 mL（第 2 頁 表 2）。 這些新抗原肽通過高溫色譜法進一步純化至適合生物學 研究的純度4。
材料和方法
試劑 以下 Fmoc 氨基酸購自 CEM Corporation (Matthews, NC) 并含有zhi定的側鏈保護基團：Ala、Asn (Trt)、Arg (Pbf)、Asp (OMpe)、Cys(Trt)、Gln(Trt) 、Glu(OtBu)、Gly、His(Boc)、Ile、 Leu、Lys(Boc)、Pro、Met、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)、Tyr( tBu) 和 Val。 Rink Amide ProTideTM LL 樹脂（離子交換容量 0.20 meq/g ）也購自 CEM Corporation。 N,N'-二異丙基碳二亞 胺 (DIC)、吡咯烷、三fu乙saun (TFA)、3,6-二氧六環-1,8 辛二硫醇 (DODT) 和三異丙基硅烷 (TIS) 購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。 二氯甲烷 (DCM)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)、無水乙mi (Et2O) 和乙酸購自 VWR (West Chester, PA)。 LC-MS 級水 (H2O) 和 LC-MS級乙腈 (MeCN) 購自 Fisher Scientific (Waltham, MA)。
多肽合成 使用 CEM Liberty PRIME 2.0 自動微波肽合成儀在 Rink Amide ProTide 樹脂 LL 上所有肽以 0.1 mmol 的規模合成。 用吡咯烷 在 DMF 中進行脫保護。 在 DMF (CarboMAX) 中使用 5倍當量的 Fmoc-氨基酸 與 DIC 和 Oxyma Pure 進行偶聯反應。 使用 TFA/ H2O/TIS/DODT 在 38 °C 下進行裂解。 裂解后，用無水乙mi沉 淀多肽并過夜凍干。
多肽分析 在配備有 Acquity UPLC BEH C8 色譜柱 (1.7 mm x 100 mm) 和 Q Exactive plus MS 的 ThermoFisher UPLC 系統上分析多 肽。 峰圖分析是在 Chromeleon 軟件上完成的。 使用 (i) H2O 和 (ii) MeCN 中的 0.05% TFA 梯度洗脫進行分離。
結果 表 1 .使用 帶有HT24 的 Liberty PRIME 2.0 上連續合成獲得 多肽各自的序列和粗純度。
結論 使用 HT 樹脂傳輸模塊的自動順序微波 SPPS 為大批量多肽的合成 提供了強大的設備。 僅在一天內完成 20 種不同新抗原肽的高純 度批量合成。 單個多肽合成在大約 1 小時內完成，純度高，產生 的廢物極少。 該批次中的所有多肽都能夠使用 Prodigy 系統的高 溫制備 HPLC 以高產率快速純化4。HT 自動樹脂裝載模塊 （ HT4、 HT12、 HT24 為 Liberty 2.0、Liberty Blue 2.0 和 Liberty PRIME 2.0 微波肽合成儀提供了強力的升級。
參考文獻 1. Hilf, N.; Kuttruff-Coqui, S.; Frenzel, K.; Bukur, V.; Stevanovic, S.; Gouttefangeas, C.; Platten, M.; Tabatabai, G.; Dutoit, V.; van der Burg, S. H.; Thor Straten, P.; Martínez-Ricarte, F.; Ponsati, B.; Okada, H.; Lassen, U.; Admon, A.; Ottensmeier, C. H.; Ulges, A.; Kreiter, S.; von Deimling, A.; Skardelly, M.; Migliorini, D.; Kroep, J. R.; Idorn, M.; Rodon, J.; Piró, J.; Poulsen, H. S.; Shraibman, B.; McCann, K.; Mendrzyk, R.; Löwer, M.; Stieglbauer, M.; Britten, C. M.; Capper, D.; Welters, M. J. P.; Sahuquillo, J.; Kiesel, K.; Derhovanessian, E.; Rusch, E.; Bunse, L.; Song, C.; Heesch, S.; Wagner, C.; Kemmer-Brück, A.; Ludwig, J.; Castle, J. C.; Schoor, O.; Tadmor, A. D.; Green, E.; Fritsche, J.; Meyer, M.; Pawlowski, N.; Dorner, S.; Hoffgaard, F.; Rössler, B.; Maurer, D.; Weinschenk, T.; Reinhardt, C.; Huber, C.; Rammensee, H.-G.; Singh-Jasuja, H.; Sahin, U.; Dietrich, P.-Y.; Wick, W., Actively personalized vaccination trial for newly diagnosed glioblastoma. Nature 2019, 565 (7738), 240-245. 2. Zitterbart, R.; Berger, N.; Reimann, O.; Noble, G. T.; Lüdtke, S.; Sarma, D.; Seitz, O., Traceless parallel peptide purification by a first-inclass reductively cleavable linker system featuring a safety-release. Chem. Sci. 2021, 12 (7), 2389-2396. 3. CEM; CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperatures. CEM Corporation Website, Application Notes. [Online]. Published Online: January 9, 2018. (accessed April 22, 2022). 4. CEM; Prodigy - Enhanced Peptide Purification at Elevated Temperature. CEM Corporation Website, Application Notes.
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