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【ISCO】反相RediSep®柱在肽分離中的應用與優化
檢測樣品：多肽
檢測項目：分離 純化
方案概述：本文介紹了使用反相RediSep?柱進行肽分離的有效方法。通過選擇合適的柱和初始條件、優化移動相和檢測波長、添加反離子以及建立合適的梯度，可以實現高效的肽分離。文章還提供了具體的操作技巧和參數調整建議，以幫助研究人員在生物化學研究中提升肽分離的效率和效果。
一、應用概述
肽可以被定義為氨基酸的短鏈聚合物。單個肽的特性當然取決于其特定的氨基酸組成和排列方式。肽具有相對的極性，其結合特性與其他蛋白質相當一致。
肽混合物可以被分離成單個肽種類。如果可以將這些單獨且更具體的肽包含在一個單一的餾分中，這將極大地加速許多科學過程。
以下是一個通用的方法，用于在可重復使用的反相RediSep® C18柱上將肽混合物分離成餾分。
通常最好從4.3克的RediSep反相柱開始。在探索特定肽的良好參數時，會使用較少的肽樣品和溶劑。一旦確定了洗脫參數，就可以根據需要擴大過程規模。回顧反相理論的應用說明AN10可能是有益的。
對于本參考文獻中使用的特定肽混合物，參數列于表1中。參數將隨肽結構而變化。
表格1：通用方法參數
二、通用方法波長
理想的波長會根據肽的結構而變化。選擇具有最高靈敏度的波長是理想的，同時避免引入過多噪聲或遺漏某些化合物。如果210 nm過于嘈雜，那么214 nm通常會提供一個更干凈的基線。環狀結構在280 nm處吸收最好，雙鍵在254 nm處，單鍵在210 nm處。推薦的通用波長對于蛋白質和肽是210 nm。
反離子
為了提高肽和柱的性能，通常使用反荷離子。這有助于提供更均勻的分離，從而改善柱性能。常用的反荷離子是0.1%（體積比）三氟乙酉夋（TFA）。將其等量添加到A和B移動相中。在整個分離過程中保持穩定反荷離子濃度會得到更一致的基線。簡單的配制方法是每升移動相中加入1毫升（0.1% v/v）。直接用移液管將TFA加入到移動相中并彳切底混合。
柱負載
這個參數根據肽的組成有很大的變化。對于4.3克的RediSep反相柱，0.5毫克應該是一個好的起點。
柱構造
柱本身由三個主要部分組成：
1. 支持介質是固定相所綁定的固體表面。
2. 固定相是附著在支持介質上的活性涂層，即C18。
3. 移動相是流過支持介質的流體，以便將肽的活性部分暴露給固定相。
移動相或溶劑系統
許多肽強烈地吸附在C18上，通常需要一個強梯度來洗脫。典型地，水用作溶劑A，乙腈用作溶劑B來洗脫肽。
梯度
在建立新方法時，通常建議創建一個從0到95% B溶劑的非常緩慢的梯度，以確保所有峰都被洗脫并且柱子被清潔。
在初始的0-95%梯度運行后，洗脫輪廓大致確定，可以根據特定肽的需要修改梯度。通過在特定的保留時間改變梯度的斜率，可以優化分離時間和峰形。
三、分析結果
圖1提供了一個參考肽的色譜圖。特定的肽是使用表1中列出的參數進行分離的。參數將隨著肽的結構而變化。
圖1：樣品肽色譜圖
四、總結
肽的純化方法可以先在較小的柱上建立，然后根據所需的樣品負載量進行放大。
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