薄基底膜腎病Ⅳ型膠原α鏈分布的免疫組化研究
張承英 朱世樂 章友康 鄭欣 鄂潔 侯平
薄基底膜腎病（TBMN）是以持續性鏡下血尿為主要表現的一種遺傳性腎病，腎小球基底膜（GBM）彌漫性變薄為該病惟一重要的病理學特征。既往關于Alport綜合征（Alport syndrome,AS），另外一種以持續性鏡下血尿,GBM變薄增厚、撕裂、分層為特征的遺傳性腎病，Ⅳ型膠原α鏈分布的免疫組化研究較多，眾多研究表明, AS患者腎小球基底膜Ⅳ型膠原α3、α4、α5鏈表達缺陷［1］,而關于薄基底膜腎病Ⅳ型膠原α鏈分布的研究甚少。本研究旨在以正常腎組織和AS患者的腎組織為對照,用抗腎抗體,抗Ⅳ型膠原α3,α5鏈NCl區單克隆抗體通過間接免疫熒光法觀察TBMN腎小球基底膜Ⅳ型膠原α鏈的分布。
一、資料與方法
1.TBMN 30例冰凍切片，取自1994年12月至1998年4月，經電鏡超微結構檢查并結合臨床及其他實驗室檢查證實為TBMN的腎活檢組織。其中男5例,女25例,年齡13～53歲,平均34.3歲,病程1個月～24年,平均50.6個月。所有病例均有鏡下血尿,尿紅細胞位相檢查為腎小球源性血尿（尿紅細胞大小不等,形態變異）,17例為單純性血尿,13例為血尿伴蛋白尿,多為輕度蛋白尿,其中3例表現為腎病綜合征,4例合并有高血壓,除1例表現為腎病綜合征者腎功能輕度受損外（肌酐清除率57 ml/min）,其余患者腎功能均正常,所有患者均無白內障,斜視等眼疾和神經性耳聾。
2.AS 5例冰凍切片，取自1991年1月至1998年4月，經電鏡超微結構檢查并結合臨床及其他實驗室檢查證實為AS的腎活檢組織,其中男3例,女2例,年齡14～31歲,平均21.6歲,病程3個月～24年,平均67.6個月。所有患者均以血尿伴蛋白尿為主要表現,2例合并有高血壓,1例腎功能輕度受損（肌酐清除率73.9 ml/min）,2例雙耳輕度神經性耳聾,1例合并先天性白內障。
3.正常對照:腎腫瘤手術所取的遠離腫瘤組織的正常腎組織為正常對照,共2例,2例均無腎炎病史,無TBMN和AS及其家族史。
4.實驗試劑：抗Ⅳ型膠原α3和α5鏈NCl區單克隆抗體購自瑞典Wieslab公司，抗腎抗體為本院1例Goodpasture綜合征患者血漿置換出的血清，抗Ⅳ型膠原單克隆抗體，FITC標記羊抗鼠IgG、羊抗人IgG均購自北京中山生物技術有限公司，以抗Ⅳ型膠原單克隆抗體為*抗體的陽性對照，不加一抗為陰性對照。
5.方法:5 μm冰凍切片在空氣中自然干燥,丙酮4℃固定10分鐘,0.01 mol/L MPBS沖洗3分鐘,3次,再用6 mol/L尿素，0.01 mol/L甘氨酸（pH 3.5）4℃變性1小時,0.01 mol/L PBS沖洗3分鐘,3次,加入一抗和二抗分別在室溫下孵育1小時后,熒光顯微鏡下觀察結果。
二、結果
經間接免疫熒光檢查,抗Ⅳ型膠原單克隆抗體、抗腎抗體、抗Ⅳ型膠原α3和α5鏈NCl區單克隆抗體在2例正常腎組織和30例TBMN患者腎小球均呈連續線狀沉積,其中抗腎抗體、抗Ⅳ型膠原α3鏈NCl區單克隆抗體主要沿GBM、腎小管基底膜沉積,抗Ⅳ型膠原α5鏈NCl區單克隆抗體主要沿GBM、包曼囊沉積,而5例Alport綜合征患者抗Ⅳ型膠原單克隆抗體在GBM上呈陽性反應，而抗腎抗體、抗Ⅳ型膠原α3和α5鏈NCl區單克隆抗體在GBM上均呈陰性反應。
討論 1996年Lemmink等［2］在TBMN患者的COL4A4基因上發現一由G到A的點突變,推測TBMN的發生與此突變有關。但關于TBMN患者GBM上Ⅳ型膠原α鏈的分布尚缺乏大宗病例的系統研究。本組通過間接免疫熒光法，在國內運用抗腎抗體、抗Ⅳ型膠原α3和α5鏈NCl區單克隆抗體檢測了30例TBMN患者腎活檢冰凍切片,結果30例TBMN患者GBM上Ⅳ型膠原α3、α5鏈分布正常,與正常腎組織分布沒有明顯差異,5例病理改變以典型的GBM撕裂,分層為特征的AS患者GBM上Ⅳ型膠原α3,α5鏈表達缺陷。關于TBMN和AS患者GBM上Ⅳ型膠原α鏈分布不同的原因目前尚不清楚，可能TBMN患者攜帶的突變對GBM的抗原性不發生影響，故腎小球基底膜Ⅳ型膠原α鏈分布正常，而AS患者編碼Ⅳ型膠原α3、α4、α5鏈的基因中任何一種基因突變致α3、α4、α5鏈不能形成穩定的Ⅳ型膠原三螺旋結構,使GBM失去了正常的抗原性［1］，故GBM上Ⅳ型膠原α鏈表達缺陷。鑒于α鏈特異的單克隆抗體在TBMN和AS患者GBM上分布的不同，對于某些臨床上難以鑒別的TBMN和AS患者可以考慮用免疫組化方法進行鑒別。
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