| 動物樣品的采集及處理方法 遺傳學數(shù)據(jù)在野生動物和圈養(yǎng)動物的保護和管理中變得日益重要。在本文中，我們總結了一些能簡便而有效地獲得樣品及數(shù)據(jù)的方法。 我們在采集樣品之前，對將要進行的遺傳學分析有所了解。然而，采集者并非都是研究者，當采集地與實驗室有相當距離時，采集者常常要保存好樣品直到有合適的接受者或存放地，這就要求采集者應具備一定的經(jīng)驗。 首先，所有樣品均應以個體序號進行標注，并且應寫上種名、性別、采樣者姓名以及采集日期，越詳盡越好，以便同一個體的不同類數(shù)據(jù)可以相互引用，另外，地理來源的標注也很重要，需要注明。對于野外捕獲的動物，有條件者在地圖上標明捕獲地及其經(jīng)緯度。對圈養(yǎng)動物的每個野外捕獲種源都要有同樣的記錄和詳盡的譜系圖，因為譜系圖可用于計算近交系數(shù)。 總之，背景資料越詳細越好，即使不能得到這里所列的全部信息，也要盡可能詳盡。 7.l．1 樣品的測量方法 在一定數(shù)量的分類群中采用的標準測量方法可用于以下四個方面： （1）分類學上：一套理想的測量方法應能大致上重建機體每個主要硬件部分的形狀和大小。 （2）不對稱性分析：機體各部分的起伏不對稱，也許表明進化過程在一定程度上正在變得不穩(wěn)定，這可能是環(huán)境壓力或近交的結果。測量不對稱時機體左右兩部分均應考慮在內(nèi)。 （3）遺傳變異：在科級水平上，如果對同一年齡的個體采用同樣的測量方法，就有可能對所選特征中的遺傳成分變異進行粗略的估計。雖然并非總是能做到這樣，但能使遺傳學家對所選特征（如生殖特征方面遺傳變異的任何丟失）進行監(jiān)視。 （4）生理檢測或記錄：采用標準測量方法得到的記錄，也許會有助于與用其他手段得到的數(shù)據(jù)起來分析。例如，如果有了精子形態(tài)的記錄，或是特殊寄生物的感染記錄，遺傳學家就能因此尋找在不同群體中這些因素與變異水平的相關性。 7.1．2 組織樣品的采集和保存 下面詳細給出針對不同研究目的的適當方法。當然，每個實驗室都有各自習慣的組織處理方法，因此，本文僅給出快速保存的有關要求，但對每種組織的可用性都有所評述，以便在用途有沖突時，能對潛在數(shù)據(jù)的可能應用作出迅速判斷。 使用腫瘤、毛發(fā)及精子樣品，保存時應特別注意。使用細胞培養(yǎng)樣品可減少對活體或新殺動物的依賴，如果培養(yǎng)物來源于腫瘤組織細胞，則可大量減少對同種動物組織的進一步需求。組織材料必須在數(shù)小時內(nèi)送到有關實驗室或用于其他的細胞培養(yǎng)。如果已經(jīng)知道DNA 序列的一小部分，就可利用PCR 技術從很少一部分組織中擴增DNA，從而使極其的樣品（如一根毛發(fā)或單個精子）具有更高的利用價值和更大的可信度。 組織必須取自活體動物或死后1～2 分鐘內(nèi)的動物，并且要快速保存起來，除非出現(xiàn)下述情況：在野外條件或是匆忙安排的活體取樣，因此沒有時間同實驗室。此時要有目的地擴大采集和儲存量。如果已經(jīng)詳細知道樣品的確切用途，則有時條件可以放寬。例如，對血液樣品來說，有些酶是不要求立即凍存的?？焖賰龃鏁r樣品可放人液氮、干冰中或直接放入－70℃冰箱。凍存樣品可在—70℃液氮、冰箱、干冰或－20℃冰箱中保存和運輸。樣品凍存及運輸均以放入液氮中效果較好。非凍結冰箱是不能用的。 7．1．2．l 用于染色體研究的軟組織的處理 室溫下將全部或部分樣品浸入0．9％的生理鹽水中，在數(shù)分鐘內(nèi)將樣品送至實驗室，zui遲也要在1～2 小時之內(nèi)送到。 研究染色體能看到有絲分裂和減數(shù)分裂，從而了解有關染色體倒位等現(xiàn)象。染色體倒位會影響到受精和遺傳重組，可能的同性個體應從染色體方面進行檢查，但對哺乳動物來說，通常不需要研究同性別的染色體。 7．1．2．2 用于成纖維細胞培養(yǎng)的組織的處理 通常來源于幼體動物的組織用于細胞培養(yǎng)較好。在一個個體中，癌組織和肺組織是的，但其他軟組織也可以用。 細胞培養(yǎng)常用的是新鮮組織，但捕殺幾天后的動物組織仍能用來培養(yǎng)。總之，樣品越快到實驗室，成功的可能性就越大。 如果取樣時需切開活體動物的皮膚，則應當在無菌的條件下進行。對細胞培養(yǎng)來說，無 菌條件下進行進一步的處理也是很有必要的，而在野外這是難以做到的。因此，一個不透風的封閉空間以及面具、手套是很有用的，至少操作人員應離開工作臺面遠一些。所有的臺面、試劑瓶、手套、儀器等使用前要用70％的酒精消毒。所用的試劑應是新鮮的，如果對其無菌性有任何懷疑（如變渾濁或變顏色）就應倒掉。 在無菌條件下將組織樣品放入0％的酒精中，搖動1 分鐘后，將樣品轉人收集液中，在室溫下放置1～4 天。如需放置更長時間，則兩天后須將組織樣品轉到運輸液中，就可再于室溫下存放幾天。轉移過程中無菌操作是很重要的，因為運輸液中一般不使用防腐劑。 收集液和運輸液一般由接受樣品的實驗室提供。成纖維細胞培養(yǎng)可生產(chǎn)出更多的材料而不必再從動物中取，達到事半功倍的效果。 7．1．2．3 用于染色體研究的血樣的采集 采血樣須無菌操作。采血用的注射器、小瓶等應用肝素潤濕。有些用品買來時就已經(jīng)用肝素處理過。迅速將血樣送往實驗室（在低溫條件下但不使其凍結）。如果條件不允許，可在無菌條件下，每 0．lml 血樣加 5ml 的血樣處理液，然后在室溫下轉送到實驗室（實驗室會有另一種準備好的處理液）。 7．1．2．4 用于酶及其他蛋白質(zhì)研究的軟組織的處理 將軟組織切成1cm 見方的小塊，包好并迅速凍存。如將組織塊浸泡在2％的苯甲醛中，在室溫下放置，某些酶的活性可保持幾個月（Nakanishi 等1969）。一些魚類蛋白質(zhì)可以用市場買來的材料進行分析，但這里的目的是區(qū)分種，而不是為了獲得詳盡的遺傳數(shù)據(jù)。 7．1．2．5 用于酶和蛋白質(zhì)研究的血樣的采集 試驗所用的注射器、試管等應用肝素包被（是鋰鹽），或者是用低溫保存的肝素潤濕。如果可能的話，所有溶液配制等操作均應在5℃條件下快速完成。對于較大體積的樣品（＞5ml），將紅細胞、白細胞、血漿分開。首先在1000r／min 離心10 分鐘，快速吸取血漿，迅速分裝凍存。然后吸出漂浮在紅細胞表面的一層白細胞帶，再用5～10 倍體積的PBS 將紅細胞洗兩次后離心，zui后將片狀沉淀物快速凍存。 白細胞層用ACK 溶解（0．15mol／dm３ 氯化銨、0．01mol／dm３ 碳酸氫鉀、0．lmol／dm３ Na２ EDTA），直到變成澄清的紅色（約 5 分鐘）。在 500r／min 離心 5 分鐘后，小心吸去 ACK 和紅細胞碎片，剩下的白細胞會重新懸浮于 ACK 中。2 分鐘后，細胞成團沉淀，此時再用 PBS 洗。如果沉淀物仍為紅色，則將整個過程重復一次，而后將其凍存。白細胞（酶的來源）也可以通過將等分血樣鋪展于20％的Ficoll、4．5％Na２ EDTA中的方法，使其沉降（10～15 分鐘），再用巴氏吸管從界面吸取白細胞，于1000r／min 離心10 分鐘，而后凍存。用 Ficoll 分離的紅細胞很難再復原。 有些蛋白質(zhì)可以用其他方式保存的血樣進行分析：①保存于5℃并在幾小時內(nèi)送到實驗室的；②凍存的全血（未處理過）；③全血或經(jīng)分離的血樣稀釋于3 倍體積的苯甲醛中，并保存于室溫下。蛋白質(zhì)電泳是用于研究種群內(nèi)遺傳多樣性或分類學差異的方法。同其他脊椎動物相比，哺乳動物血樣并非是很好的酶和蛋白質(zhì)的來源，有時取軟組織更好。 7．l．2．6 用于核DNA 研究的軟組織的保存 將組織切成1cm 見方的小塊，包起來凍存?；驅⑵浞湃霂妆扼w積的80％乙醇（分析 純）中，于4℃下存放。兩種方法中以前一種方法更好。 7．l．2．7 用于核DNA 研究的血樣的保存保存血樣可用占血樣體積0．01 倍的15％ K２EDTA 作為抗凝劑，并且能夠加入0．05倍的蛋白酶K（0．1％，核酸級，Boehringer Mannheim 冰凍保存，用新解凍的），充分混合后迅速凍存。血與EDTA 混合液可在室溫下放置幾天，但DNA 的質(zhì)量不會太好。 DNA 技術可以分析幾乎所有組織樣品基因組的任何一部分，從而能夠克服用蛋白質(zhì)研 究變異及分類學時出現(xiàn)的有關問題。 7．1．2．8 用于制備DNA 的毛發(fā)及精子樣品的保存 雖然以前從干燥或用福爾馬林固定的毛發(fā)及精子樣品中提取過DNA，但zui可靠的保存方法是凍存（Impraim 等 1987；Thomas 等 1990）。必須注意的一點是，盡可能地減少其他來源的DNA 對樣品的污染，特別是實驗者的手，因為PCR 反應對微量DNA 是很敏感的。較好的做法是儀器經(jīng)烘烤（180℃過夜）或火焰消毒，其他所用的每一件東西（手套、試管、工作臺面）用一套新的、經(jīng)γ射線消毒處理的商業(yè)化產(chǎn)品。精子樣品也可以用來作常規(guī)的遺傳分析，如不需要人工控制交配就可進行連鎖研究（Li 等1988）。當然，精子樣品還可用于人工授精，這在圈養(yǎng)動物的遺傳管理上是很重要的。 7．1．2．9 用于提取線粒體DNA 的軟組織及血樣的保存 將樣品在4℃下保存，并盡快送到實驗室。血樣貯存于有葡萄糖檸檬酸包被的真空管中時，可以凍存幾年（在液氮中），但解凍后只能在室溫下保存幾天時間。線粒體DNA 的分析對研究物種在地理分布上的變異及構建譜系尤其有用。 7．1．2．10 用于提供RNA 的軟組織的保存 RNA 會在極短的時間內(nèi)被破壞，因此必須在動物死亡或活檢后1～2 分鐘內(nèi)迅速將其切成1cm 的小塊，并放人液氮中凍存。 RNA 可用于 DNA 文庫的構建，它能為遺傳學家提供探針，用于個體總DNA 中單個活性基因的分析。雖然來源于其他動物的探針也能用，但用同種的探針效果。 7．2 動物組織DNA 樣品的提取 目前提取高分子量的DNA 的方法已有很多，我們在這一部分中除了介紹常規(guī)的DNA提取方法外，還將著重討論由微量樣品（如毛發(fā)）和陳舊古老樣品提取DNA 的一些新方法。 7．2．l 提取動物總DNA 的常規(guī)方法 從動物組織中提取DNA 的常規(guī)步驟如下： （1）取動物組織100mg 左右于樣品管中，用干凈的剪刀將組織塊剪碎。 （2）在樣品管中加入如下試劑： 500μl STE 溶液 25 μl 蛋白酶 K（Proteinase K，10 mg／ml） 75μl 10％ SDS （3）混勻后置56℃下消化2 小時以上（隔一定時間混勻一次）。 （4）加人等體積的飽和酚溶液，輕輕顛倒混合5 分鐘以上（用于rDNA 和RAPD 分析的樣品需抽提24 小時）。 （5）7 000r／min 離心5 分鐘。 （6）小心將上層清液移至另一干凈的離心管中，加入等體積的苯酚及氯仿，并重復步驟（4）和（5）的抽提過程。 （7）以等體積的氯仿（內(nèi)含1／25 體積的異戊醇）重復步驟（4）和（5）的抽提過程。 （8）在上清液中加入 1／10 體積的 3mol／dm３NaAc 或 5mol／dm３NH４Ac、2 倍體積的冷無水乙醇或1 倍體積的異丙醇，以沉淀DNA。 （9）置—70℃下沉淀2 小時或置—20℃下沉淀過夜。 （10）7 000r／min 離心10 分鐘，再以 70％冷乙醇洗滌DNA 沉淀一次。將沉淀置真空干燥器或37℃溫箱中干燥。 （11）以適量的TE 溶液（200～500μl）溶解DNA 樣品。 （12）以分光光度計測定DNA 的濃度（260nm），260／280nm 的光密度比值應在 1．8 以上，否則提示可能有蛋白質(zhì)或苯酚的污染。 （13）以TE 溶液將DNA 樣品稀釋成所需的工作液的濃度。 （14）取2μl 左右的樣品進行電泳檢測，以判斷 DNA 是否有降解以及是否需要消除RNA。 7．2．2 微量動物組織樣品的總DNA 提取方法 從微量組織中提取DNA 的方法是1989 年由Singer-Sam（Walsh 等1991）發(fā)展起來的。此方法的基本原理是采用 BioRad Chelex 100（一種螯合劑）提取DNA。此方法簡便、快速，提取后的DNA 樣品可以直接作為PCR 的模板。具體的操作步驟如下： （1）取一小塊冰凍的組織（少于1mg，可用經(jīng)消毒的槍頭鉆?。?～3 根帶有毛根的毛發(fā)（需先經(jīng) 90％、70％的乙醇和滅菌水依次清洗，并剪去毛干部分），或 1～5μl 血液，加入經(jīng)過高溫消毒的離心管中。離心管內(nèi)事先加入 500μl 5％的Chelex 溶液。 （2）將樣品管在56℃下放置1 小時或更長時間，直至組織樣品成粉末狀（不同組織所需時間各不相同）。 （3）在振蕩器上振蕩10～15 秒鐘。 （4）在 95～100℃下煮 15～40 分鐘。 （5）在振蕩器上振蕩10～15 秒鐘。 （6）將樣品管在4℃下保存，進行PCR 反應之前再次離心，使Chelex 顆粒沉淀。取上清液（1～10μl）作為DNA 模板。 7．2．3 陳舊、古老DNA 樣品的提取方法 對于陳舊、古老DNA 的研究始于80 年代中期。1985 年，Paabo 采用克隆的手段從古 埃及木乃伊中提取并測定了一段DNA 序列。然而，較為廣泛地開展對古老DNA 的研究是在多 聚酶鏈式聚合反應（PCR）發(fā)明以后才開始的（Mullis，F(xiàn)allona 1987）。 經(jīng)過一定時期的物理、化學作用（幾十年至幾百萬年）的DNA 往往存在比較嚴重的降解，DNA 片段常常僅有幾百個bp 的長度，并且可能存在堿基的修飾和一些抑制PCR 反應的物質(zhì)。因此，在從陳舊或古老樣品中提取DNA 時，zui為關鍵的問題就是防止現(xiàn)代DNA 的污染。進行DNA 提取操作的所有器皿、器械和試劑均要進行滅菌處理，提取過程應在超凈臺中進行。此外，提取時應設陰性對照，以監(jiān)測是否存在外源DNA 的污染。下面介紹的是一種較為簡便的提取方法。 （1）取樣品少許（如哺乳動物的皮張可取 1cm × 1cm 見方的小塊），用剪刀、手術刀等器械對樣品表面進行處理，除去zui容易遭受外來污染的表層。對于骨骼、琥珀等堅硬的樣品則需要用小鋼鉆等特殊器械從內(nèi)部取得樣品。 （2）經(jīng)過表面處理的樣品用90％乙醇、70％乙醇和去離子水依次進行清洗。 （3）在滅菌的 Eppendorf 管中加入 200μl 去離子水、10μl 蛋白酶K（10mg／ml）和 1／10 體積的（20μl）10％的β-巰琉基乙醇。處理過的樣品放入上述溶液前要盡可能剪碎。 （4）在56℃下消化48 小時。 （5）樣品管中加入等體積的5％～10％的Chelex100 溶液，在旋渦混合器上振蕩5～10秒鐘，然后在98℃下放置20～60 分鐘。 （6）振蕩混合5～10 秒鐘，并使之冷卻至室溫。 （7）12 000r／min 離心 5～10 分鐘。 （8）小心取出上層清液，置另一干凈的管中保存。 7．3 植物總DNA 的提取 1976 年，Millgan 用Blin 和Stafford 描述的方法分離了植物DNA，然而這些DNA 是不能用于克隆的。在發(fā)明了去除植物DNA 上污染物的方法之后，人們可用分離動物組織DNA 的方法分離植物DNA。去除植物帶電高分子污染物的方法有核分離（Bickle 等1977）。CTAB（十六烷基*基溴化銨）分離（Murray，Thompson 1980）和鹽酸／十二烷基肌氨酸鈉分離（Sung，Slightom 1981）等。在這些方法中，CTAB 方法因簡便、快速而使用zui廣泛。收集和保存植物組織的方法對于 DNA 的產(chǎn)量和質(zhì)量也有很大影響。雖然已能成功地從植 物標本和化石中分離出 DNA（Doyle，Dickson 1987），但采用新鮮材料能產(chǎn)生的結果，特別是對于產(chǎn)生大量單寧、酚或其他次級代謝產(chǎn)物的種。如材料不能馬上進行提取，應保存在冷而濕的地方，例如在冰盒中。如有必要可以冷凍保存。如果沒有條件，在無水CaSO４瓶中快速干燥（Liston 等 1990）。DNA 的提取應盡快進行，以防其降解（Pyle，Adams1989）。 提取DNA 的過程中有許多因素能導致DNA 降解。首先是物理因素。因為DNA 分子量較大，機械張力或高溫很容易使DNA 分子發(fā)生斷裂。因此，在實際操作過程中應盡可能輕緩，盡量避免過多的溶液轉移及劇烈的振蕩等，以減少機械張力對DNA 的損傷，同時也應避免過高的溫度。其次，細胞內(nèi)源DNA 酶及細胞破裂釋放的次級產(chǎn)物也會導致DNA 降解。所以在提取DNA 的實驗中，設計了許多可供選擇的分離緩沖液，以適應不同的植物材料。分離緩沖液的pH 值有時需要進行改進，pH 應避免接近降解酶的zui適點。大多數(shù)降解酶和脂肪氧合酶pH 值的zui適點在 5．0～6．0 之間，而DNA 酶pH 值zui適點在 7．0 左右（Dunham，Bryant 1963）。由于在過酸的條件下，DNA 脫嘌呤會導致DNA 的不穩(wěn)定，極易在堿基脫落的地方發(fā)生斷裂，所以大多植物DNA 提取緩沖液的pH 值為8．0，有的甚至為9．0。緩沖液中包含了大量的復合物，如 EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、牛血清白蛋白（BSA）、β-巰基乙醇、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇（DTT）、抗壞血酸（Vc）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、二乙基焦碳酸鹽（DEPC）、溴化乙錠（EB）等（Hallick等1977）。但由于上述物質(zhì)有些是抑制內(nèi)切酶和非特異性核酸酶的，所以在其后的步驟中要將其除去。分離DNA 與蛋白質(zhì)一般采用苯酚－氯仿抽取的方法。苯酚、氯仿對蛋白質(zhì)均有*的變性作用，而對DNA 無影響。下面的方法描述DNA 與污染物多糖的分離，也可用陰離子交換層析儀來進行。下面列出了3 種常見的分離植物總DNA 的方法。3 種方法溶解細胞膜和分離蛋白質(zhì)的方法不同，各有其優(yōu)、缺點。 7．3．1 CTAB 緩沖液方法 這是zui廣泛地用來分離植物DNA 的方法，對大多數(shù)植物種都適用，特別是當樣本數(shù)量很小時。此法運用陽離子去污劑CTAB 溶解植物細胞膜，并與DNA 形成一復合物。其優(yōu)點是不需要準備大量的植物組織，而且適合像葉、根、種子、胚、胚乳、花粉和懸浮培養(yǎng)的組織等多種類型的組織（Rogers，Bendch 1985）。另外，此法對樣品數(shù)量的要求也不高，從小到毫克數(shù)量的標本（木乃伊、化石）到許多克的新鮮材料均可使用（Golenberg 等 1990；Rogers Bendch 1985）。 7．3．l．1 CTAB 的實驗方法 1．材料 （1）2 倍CTAB 緩沖液： 100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0 1．4mol／dm３NaCI 20 mmol／dm３EDTA 2％ CTAB（W／V） 1％ PVP-360（W／V） 0．2％ß-巰基乙醇（體積比，用前在通風櫥中加） （2）清洗緩沖液： 76％乙醇 10 mmol／dm３乙酸銨 （3）懸浮緩沖液： 10 mmol／dm３乙酸銨 0．25 mmol／dm３EDTA，pH 值 8． 2．步驟 （1）加熱分離緩沖液、研缽、研杵到60℃。 （2）在熱研缽中放人0．5～1．5g 新鮮或冰凍的葉子，用7．5ml 2 倍CTAB 分離緩沖液研磨（可加些石英砂幫助研磨）。對凍干的組織用1 倍CTAB 緩沖液研磨。把研碎的組織倒入50ml 管中，再用0．5ml 2 倍CTAB 緩沖液沖洗研缽，將沖洗液加到管中。 （3）將試管在60℃下放置30～60 分鐘，然后輕輕振蕩，使之充分混合后降至室溫。 （4）在試管中加入10ml 氯仿－異戊醇（24:1）萃取液（如顏色深可再進行一次），輕輕搖晃使其混合，在室溫下1500r／min 離心5 分鐘，使其分相。 （5）將上層的水相倒入－15ml 管中，加2／3 體積的冷異丙醇，輕輕混合以沉淀核酸。如果看不到核酸沉淀，可在－20℃下放置20 分鐘或更長時間。 （6）室溫下 800r／min 離心 3～5 分鐘，如果看不到小團或沉淀，可在－20℃下放置 20分鐘再離心。 （7）小心地倒掉上清液，不要倒掉核酸，這時的核酸一般松散地貼在管的底部，加 15ml清洗緩沖液，輕輕地旋轉清洗沉淀物，15～20 分鐘后核酸將變得更白。 （8）室溫下800r／min 離心5 分鐘（如不充分，則加大離心速度或延長離心時間），倒掉清洗緩沖液，將管倒扣在紙巾上，讓沉淀物干燥，小心不要讓DNA 滑掉。 （9）按沉淀物的大小用少量懸浮緩沖液（10～100 μl）懸浮DNA。 （l0）用100μg／ml RNAase 在 37℃下溫育 30～60 分鐘。 （11）如果組織包含單寧或其他次級產(chǎn)物，可以對 DNA 作進一步純化（可用氯仿、苯酚純化）。一些材料可能需要用氯銫（CsCl）梯度純化。上述方法也可以進行改進，像巰基乙醇的濃度可以提高至 25mmol／dm３，也可加入 l％的抗壞血酸、DTT 等，CTAB 也可用 SDS 取代（Golenberg 等1990），也可用 TE（10mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8.0，lmmol／dm３EDTA）作懸浮緩沖液。 7．3．l．2 CTAB 沉淀法 1．材料 2 倍CTAB 分離緩沖液；沉淀緩沖液： 100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；20 mmol／dm３EDTA；2％CTAB（w／V）。 2．步驟 （1）與7．3．1．1 中前4 個步驟同。 （2）吸取上層水相，將其例入一個15ml 管中。 （3）加 3 倍體積的沉淀緩沖液，使NaCI 的濃度減少到 0．35mol／dm３，室溫下放置 30分鐘。 （4）室溫下 2 000r／min 離心 5 分鐘，以沉淀 DNA。 （5）根據(jù)沉淀物的大小，用少量的懸浮緩沖液（10～100μl）懸浮DNA。 （6）雖然氯仿或苯酚提取DNA 是有效的，但是對那些包含單寧或其他次級產(chǎn)物的組織，可以在氯化銫梯度上進一步純化。 7．3．2 蛋白質(zhì)沉淀方法 這個方法可以產(chǎn)生高質(zhì)量的DNA，但產(chǎn)量也是zui低的。一般在沉淀核酸之前用乙酸鉀沉 淀蛋白質(zhì)和多糖（Dellaporta 等1983；Galau 等1988；Hughes，Galau 1988）。此方法不需要有機提取，而且快速，所以對大量樣品比較合適。 1．材料 提取緩沖液：100mmol／dm３ Tris-HCI，pH 值8．0；50mmol／dm３EDTA，pH 值8．0；500mmol／dm３ NaCl；2％SDS（w／v）；l％PVP-360（w／v）；0．1％β-巰基乙醇（體積比），用之前在通風櫥中加。 2．步驟 （1）用液氮在研缽中研磨1．0g 新鮮葉子，可以加一些石英砂幫助研磨。將研磨完畢的粉末貯存在－80℃冰箱中，在加提取液之前，不要讓植物材料融化。 （2）在冰凍的組織中加 6ml 提取緩沖液，轉到一個15ml 的離心管中，充分振蕩大約30 秒鐘，使之混合均勻，然后在65℃下放置20 分鐘。 （3）往管中加入2ml 5mol／dm３乙酸鉀（pH 值6．5），充分搖勻，在冰水中放置5 分鐘。隨著不溶的十二烷基硫酸鉀的沉淀，大部分蛋白質(zhì)和多糖作為復合物被除去了。 （4）在 4℃下 2 000r／min 離心 20 分鐘。 （5）吸出上清液，將其倒入一個干凈的 15ml 的離心管中，不要帶入顆粒物質(zhì)，然后加 4ml 異丙醇輕輕混合，在－20℃下放置。 （6）在4℃下 2 000r／min 離心 15 秒鐘，DNA 沉淀后，輕輕地倒掉上清液，在紙巾上倒扣10 分鐘或更長時間，以干燥沉淀物。 （7）將沉淀物放在 100TE 中溶解，然后將溶液倒入一個1．sml 離心管中，離心 5分鐘，移去不溶的沉淀。 （8）將管中上清液倒入另一個 1．5ml 離心管中，加 75μl 3mol／dm３ NaAc（pH 值 7．6）和500μl 冷異丙醇，充分混合，在—20℃下放置1～2 小時，拿出后再在室溫下放10 秒鐘，使管中DNA 沉淀。 （9）用 500μl 80％乙醇洗沉淀物 10 分鐘，離心 1 分鐘，干燥沉淀物 10 分鐘。 （10）根據(jù)DNA 沉淀物的大小，用少量的 TE（10～100μl）溶解DNA。 7．3．3 氯化銫方法 這個方法的原理是根據(jù)在氯化銫（CsCl）中的不同密度梯度來分離細胞成分。此方法可以產(chǎn)生大量高純度的DNA，但費時，而且需昂貴的儀器設備，對需要復雜的有機提取或沉淀的材料比較適合（Carr，Griffith 1987；Weeks 等 1986）。在一些情況下，它可能是在含大量次級產(chǎn)物的植物中提取高質(zhì)量DNA 的*方法。DNA 可以在一個平衡的CsCl 梯度中通過與以下幾個染料中的一個結合而被純化， 這幾個染料為溴化乙錠（ Ethidium bromide）、Bisbenzimicle、碘化丙錠（propidium iodide）、Bisbenzimide，它們不同的浮力密度對分離不同的染色體組特別有用。 7．3．4 PCR 小量制備法 此方法的優(yōu)點是一次可以提純很多樣品，比較快速，而且小于10mg（50mm）的新鮮葉子材料就可以產(chǎn)生足夠的DNA，產(chǎn)生的DNA 對雜交實驗是可用的（Millgan 1992）。這個方法存在的問題是DNA 沉淀物可能不夠緊密，或不一定能形成一緊密的DNA 沉淀。 1. 材料 分離緩沖液：200 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；250 mmol／dm３NaCI；25 mmol／dm３EDTA； 0．5 ％ SDS。 2．步驟 （1）用1．5ml 離心管研磨小的組織樣品?？扇」芸诖笮〉男迈r葉子（＜10mg），凍在液氮中 的葉子也可用。 （2）在研碎的樣品中加 400μl 的分離緩沖液，用適合的速度渦旋 10 秒鐘，以分散開樣品。 （3）在室溫下將1．5ml 離心管中樣品離心 12～15 分鐘，沉淀細胞內(nèi)物質(zhì)。 （4）搜集300μl 的上清液，棄去沉淀。 （5）在上清液中加300μl 預冷異丙醇，倒轉樣品1～3 次，使之充分混合，在室溫下至少放 置5 分鐘。 （6）將微離心管中的樣品在室溫下離心20 分鐘，以搜集沉淀的DNA。 （7）棄去上清液，用300μl 80％的乙醇室溫下沉淀 10 分鐘。 （8）室溫下離心樣品12 分鐘，棄去上清液。 （9）用300μl 80％的乙醇再洗后，室溫下離心 5 分鐘，棄去上清液。 （10）室溫下干燥樣品1 小時或將樣品放過夜。 （11）用 100μl TE 懸浮樣品。 |
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