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第四軍醫大學學報2000年第21卷第4期

商立軍　臧益民　王春梅　臧偉進　董明清　陳賢明　王四旺

　　摘　要:目的　觀察降鈣素基因相關肽（CGRP）對急性分離心肌細胞在模擬缺血缺氧狀態 下胞內鈣的影響.方法　急性分離心肌細胞在模擬缺血缺氧狀態下，以Fluo-3作為鈣指示劑，用共聚焦顯微鏡測定胞內鈣的變化.結果　急性缺血缺氧時，心 肌細胞胞內鈣濃度降低，加入CGRP后，鈣濃度恢復；先加入CGRP,再在缺血缺氧的條件下，胞內鈣濃度基本保持不變.結論　CGRP可恢復因急性缺血缺氧而導致的細胞內鈣濃度降低.

　　關鍵詞：降鈣素基因相關肽；缺血；缺氧；肌細胞；胞內鈣；Fluo-3

　　0　引言

　　降鈣素基因相關肽（CGRP）是一種內源性生物活性多肽，對心血管系統的活動具有十分重要的調節作用，有明顯的抗心律失常作用，可引起正常及缺血狀態下心肌細胞離子通道的變化，但其作用機制尚有待進一步研究. 在模擬缺血缺氧狀態下,我們用共聚焦顯微鏡結合Fluo-3染色技術,觀察C gRP對急性分離心肌細胞胞內鈣的影響.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　液體配置臺氏液（單位為mmol·L^-1）　NaCl143, KCl 5.40, Mg Cl₂ 0.50, CaCl₂ 1.80, HEPES 5.00, NaH₂PO₄0.33, Glucose 5.50, pH值用NaOH調至7.35 . 無鈣臺氏液：臺氏液中去除 CaCl₂即可.含酶液：無鈣臺氏液中加入0.1 g·L^-1膠原 酶和0.7 g·L^-1的BSA. KB液（單位為 mmol·L^-1）： l-glutamic acid 70, KCl 25, taurine 20, KH₂PO₄ 10, MgCl₂3, HEPES 10, Glu cose 10, EGTA 0.50, pH值用KOH調至7.35.模擬缺血缺氧液：臺氏液中去除 Glucose,將 pH值降到6.8，且實驗前用純氮氣飽和至少1 h. CGRP在實驗前加入到臺氏液中，zui終濃度為 1 nmol·L^-1.

　　1.1.2　豚鼠心肌細胞分離　豚鼠由本校實驗動物中心提供，雌雄不拘，體質量200～250 g，10 g·L^-1戊巴比妥鈉（ip40 mg·kg^-1）麻醉. 氣管插管后在正壓人工呼吸狀態下開胸，充分暴露心臟和升主動脈，然后在原位進行主動脈插管，摘出心臟后置于Langendorff裝置進行主動脈逆向灌流（灌流與插管同步進行）. 先用臺氏液灌流3 min左右，復跳以充分沖洗冠脈內殘血，再用無鈣臺氏液灌流直至心臟*停跳. 再用含有0.1 g·L^-1膠原酶（Yakult,日本）和0.7 g·L^-1 BSA（華美公司）的無鈣臺氏液灌注約5 min，zui后用KB液沖洗殘酶 約5 min. 將心臟從Langendorff裝置上取下，置于37℃ kB液中剪碎，溫育，吹打5～10 m in. 經過濾后置于室溫下靜置1 h后進行實驗. 整個灌流系統溫度保持在37℃，所有液體均用純氧飽和.

　　1.2　方法　急性分離心肌細胞在模擬缺血缺氧狀態下胞內鈣離子的測定原理: f luo-3是一種敏感性鈣指示劑，能特異性地與Ca²⁺結合，并在一定波長激發光激發后產生熒光，且與Ca²⁺結合后其熒光光譜發生變化，其熒光強度與Ca²⁺濃度成正比，因而可用于觀察Ca²⁺的動態變化，但Fluo-3為極性大的酸性化合物，難以進入細胞，而當其結合上親脂的乙酰氫甲基酯成為脂溶性的Fluo-3/AM,再與細胞溫育時，很容易透過細胞膜，胞質內的非特異性酯酶將其酯解脫去脂基生成游離的Fluo-3.

　　1.2.1　Fluo-3/AM的負載　用臺氏液洗滌標本2次后，于室溫避光條件下 用Fluo-3/AM（10 mg·L^-1）負載細胞約30 min. fluo-3/AM預先按1 g·L^-1溶 于DMSO配制，混勻后存于-20℃.然后將細胞滴加到特制的培養皿中，靜置貼壁后再用臺氏液沖洗細胞2～3次，即可在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察、測量.

　　1.2.2　細胞內鈣的測定　將負載后的細胞放在特制的培養皿下，常溫下測定所選定的 細胞內的鈣值，然后依實驗條件分別加入含CGRP的臺氏液、缺血缺氧液或正常臺氏液，時間間隔5～10 min,分別測定各時間點的鈣值，動態掃描細胞內熒光強度變化.我們使用的是 Bio Rad 公司的MRC-1024 LSCM，其單幅采樣頻率可達4 hz，如需觀察Ca²⁺的快速變化，可線掃方式，則其采樣頻率為488 Hz. 與Ca²⁺結合的Fluo-3可以被488 nm的氬 離子激光激發，可在525 nm處探測到熒光發射，其熒光強度的變化可指示胞內游離鈣濃度的相對變化. 未經校對時雖不能得到［Ca²⁺］_i的值，但通過記錄熒光強度的變化，可觀察到胞內［Ca²⁺］_i的空間分布及藥物等條件改變時胞內［ ca²⁺］_i的變化幅度.

　　2　結果

　　2.1　CGRP對缺血缺氧后胞內鈣的影響　心肌急性缺血缺氧即刻，胞內鈣降低且基本穩定,1 min后加入CGRP可見胞內鈣濃度迅速升高 ，5 min后繼續升高，可上升到未缺血缺氧前的水平.然后用臺氏液洗脫上述作用，胞內鈣又回復到缺血缺氧后的狀態（Fig 1）.

　　2.2　預先加入CGRP再缺血缺氧時胞內鈣的變化　先加入CGRP可略微升高胞內鈣的值，但不顯著且隨時間的延長，5 min及10 min升高的幅度不大.此時加入缺血缺氧液，胞內鈣幾乎沒有變化；開始時整體都略有抬高，但3 min后 即恢復，10 min后用臺氏液洗脫，胞內鈣值能回復到靜息狀態的水平（Fig2）.

圖 1　缺血缺氧后加入CGRP細胞內熒光光密度曲線

　　fig 1　Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxia, and then with CGRP

圖 2　預先加入CGRP再缺血缺氧時細胞內熒光光密度曲線

　　fig 2　Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxi a with added CGRP in advance

　　3　討論

　　細胞內游離Ca²⁺在細胞信息傳遞過程中起著重要的作用.［Ca²⁺］ _i能反映細胞的狀態、藥物和環境等對細胞的影響.測量細胞內游離Ca²⁺的方法有：鈣離子選擇性微電極法 、放射示蹤法和標記示蹤法等^［1］.我們采用第三代Ca²⁺熒光指示劑Fluo-3 , 利用激光共聚焦掃描技術來 觀察胞內Ca²⁺的空間和時間變化. fluo-3是*在可見光區有激發峰的熒光劑，可 以避免紫外光對細胞的損害和激發自熒光傾向，它和Ca²⁺結合后熒光強度增強40倍,故Fluo-3適用于觀察Ca²⁺的空間分布和快速時間變化,是目前熒光劑中性能*，應用zui多的一種.

　　CGRP對缺血缺氧時胞內鈣的影響可能是各種因素共同作用的結果：首先,細胞處于急性 缺血缺氧早期狀態時，膜去極化可導致Ca²⁺內流減少，從而使胞內鈣濃度降低.同時 ，缺血 時細胞內ATP水平降低，可激活I_K，ATP電流，使心肌細胞復極明顯加速，從而使進入細胞內 Ca²⁺減少. 再者,CGRP 可激活Ca²⁺通道，促進L型Ca²⁺內流增加，使胞內鈣濃度升高. 這可 能是因為CGRP通過作用于其特異受體，激活細胞內腺苷酸環化酶-環磷酸腺苷系統，引起cA m P增加,再激活某種蛋白激酶，使鈣通道蛋白磷酸化，增加鈣通道的開放概率和時間的緣故.另外還有,Ca²⁺引起Ca²⁺釋放（calcium-induced calcium release, CICR）的 機制等^［2-4］.我們的研究結果表明，在急性缺血缺氧時,急性分離心肌細胞胞內鈣濃度降低，CGRP可引起 胞內鈣濃度稍微升高，且可改變缺血缺氧引起的胞內鈣濃度的降低.這種鈣的變化無疑改變了細胞內環境的穩定，同時也說明胞內鈣是受多種復雜因素調控的，其詳細機制還需進一步實驗來闡明.

　　基金項目:國家自然科學基金資助項目（39970273）

　　作者簡介：商立軍（1969-）, 男（漢族），河南省濟源市人.講師，博士生 （導師臧益民）. 已發表論文30篇. .（029）3374521商立軍（第四軍醫大學基礎部:生理學教研室，陜西西安 710033）

　　臧益民（第四軍醫大學基礎部:生理學教研室，陜西 西安710033）

　　董明清（第四軍醫大學基礎部:生理學教研室，陜西 西安710033）

　　王春梅（第四軍醫大學基礎部:中心實驗室，陜西 西安 710033）

　　臧偉進（西安醫科大學心血管生理藥理研究室,第四軍醫大學）

　　陳賢明（西安醫科大學西京醫院耳鼻咽喉科,第四軍醫大學）

　　王四旺（西安醫科大學心藥物研究所,第四軍醫大學）

　　參考文獻:

　　［1］ Brandes R, Figueredo vM, Camacho SA et al. Quantitation of cytosolic ［Ca²⁺］_i in whole perfused rat hearts using indo-1 fluorome try［J］, Biophys J,1993;65:1973-1979.

　　［2］ Cornfield DN, Stevens T, Mcmurtry IF et al. Hypoxia-induced i ncrease in fetal pulmonary artery smooth muscle cell ［Ca²⁺］_i is mediat ed by entry of Ca²⁺ through voltage-operated Ca²⁺ channels （A bstract）［J］. Pediatr Res, 1993;33:320-321.

　　［3］ Berridge MJ. Elementary and global aspects of calcium signalling ［J］. j Physiol, 1997;499（2）:291-306.

　　［4］ Lopez-lopez JR, Shacklock PS, Balke CW et al. Local calcium tra nsients triggered by single L-type calcium channel currents in cardiac cells［J］. Science,1995;268（5213）:1042-1045