2021年10月27日，來自全國各地的Leica STED用戶齊聚上海，參加了2021年徠卡STED club顯微成像技術交流會。
開幕式上，徠卡顯微系統中國區總經理陳淮先生對各位專家的蒞臨表示了歡迎，回顧了Leica在超高分辨成像領域多年的耕耘，并表示Leica會堅持和客戶共同成長，為客戶們提供更好的產品和服務。
會上諸多Leica的資深用戶分享了自己的研究成果與心得體會，我們一起來回顧下吧。
講題一：超分辨成像技術研究進展
講者：深圳大學 屈軍樂 教授
本次徠卡STED用戶會學術交流環節的開場報告由深圳大學物理與光電工程學院的屈軍樂教授帶來，報告題目為“超分辨成像技術研究進展"。屈教授長期從事超分辨熒光顯微技術及其生物醫學應用研究并在該領域造詣頗深。本次報告中，屈教授不僅向我們介紹了他所帶領的研究團隊一路走來所發展的STED技術（包括自適應光學STED、相圖分析STED、數字增強STED、時空調制STED、頻率調制STED等）及其應用，還和我們分享了他們團隊熒光染料開發的成果及寶貴經驗。將STED的成像技術提升和新型熒光染料“雙劍合璧"后，屈教授的團隊實現了STED空間分辨率提升、長時間活細胞成像、低損耗光功率成像等多項技術突破。屈教授坦言，他在99年剛到深圳大學時就接觸到徠卡SP2共聚焦，至今使用過多款徠卡顯微成像設備，并對徠卡顯微鏡的成像質量和硬件品質給予了很高的評價。
講題二：受激輻射顯微鏡在多種生物樣品中的應用
講者：上海科技大學 李曉明 主任
李曉明老師作為上海科技大學生命學院分子影像平臺主任，自2016年平臺成立以來，針對實驗室不同研究需求采購了多個廠家的超高分辨率顯微鏡，其中就包括徠卡STED納米顯微成像設備。此次會議中李老師針對STED成像優勢、成像過程中遇到的問題、解決方法及實際應用展開了詳細介紹。
李老師首先就幾臺超高顯微鏡的特點，包括分辨率、靈敏度、特殊制樣、所見即所得等多方面進行對比。STED納米顯微鏡在分辨率方面可突破50nm，并做到所見即所得，但由于STED技術特點，獲得高分辨率的同時會受到一些限制，比如需要特殊制樣，樣品不易太厚，成像深度不夠，樣品本身需要一定的熒光亮度和信噪比，并且由于較強的STED損耗光無法進行長時間活細胞成像等。隨后李老師針對這些問題給出了一些解決或優化方法，在樣品制備時，李老師推薦參考徠卡STED樣品制備手冊The_Guide_to_STED_Sample_Preparation_MC-0002370_25032021.pdf ，其中會標注注意事項及推薦的染料信息，值得一看。總結幾點：優先選擇775脈沖激光器；選擇受激輻射效果好、信號亮、熒光穩定的染料；選擇合適封片劑和標準蓋玻片可減少折射率的影響，提高成像深度。在拍攝多通道時，注意拍攝順序，當不同通道出現位置色差時可用STED標尺校正。超高顯微鏡的共定位分析不再簡單的看兩個通道是否重合，而是通過測兩個蛋白間的距離來判斷相關性。并且結合熒光壽命的新一代TauSTED的出現使得對厚樣品不同層、活細胞不同時間的連續成像成為了可能。
講題三：FLIM-FRET及STED技術聯合使用在呼吸道病毒科研中的應用
講者：中國醫學科學院醫學生物學研究所 陳燕麗 助理研究員
陳老師在講座中介紹到共聚焦顯微鏡在呼吸道病毒的研究中應用領域很多，包括病毒與宿主蛋白的相互作用，例如病毒感染細胞會發生線粒體應激，產生線粒體DNA釋放，N蛋白與其他蛋白的離體和在體相互關系等。
陳老師所在課題組制備了EVD68病毒的單克隆抗體A6-1,,為了研究抗體和病毒顆粒的相互作用，利用了FLIM-FRET技術，測定了兩個毒株（KM毒株，Fermon毒株）的六個病毒片段和抗體的相互作用。發現VP1-1與A6-1的相互作用FRET高，并且使用其他的研究手段確定了二者的結合位點。
還研究了流感病毒的單克隆抗體CR9114，這個抗體和高危的流感毒株H1N1及H7N9的親和力不高。通過改造抗體的輕鏈和重鏈，并且測定了和H1N1及H7N9的FRET效率，證實通過改造提高了CR9114和H1N1和H7N9的結合效率。還使用STED超高分辨顯微鏡觀察了納米顆粒疫苗的超微結構。
最后，陳老師總結道，FLIM-FRET可以用于呼吸道病毒顆粒和其抗體之間結合力的篩選，也可以用于改造后的抗體親和力鑒定，在呼吸道病毒研究方面有廣泛的應用前景。
講題四：Super-resolution microscopy in biomedical research: challenges and potentials
講者：Christian Eggeling, Friedrich Schiller University Jena
來自于德國耶拿大學的Eggeling教授在此次講座中主要介紹了他們實驗室在生物膜分子運動研究中STED-FCS的應用。分子擴散運動一般可用于分子結合力的研究，例如，熒光標記的小分子在和大分子結合后，由于質量變大，運動速率降低；另一個重要的應用在于在納米尺度上研究細胞膜上的生物活性。而研究分子擴散運動的經典方法之一就是熒光相關光譜（Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS）。FCS通過測定溶液中微區內發光粒子因布朗運動或化學反應而產生的熒光漲落現象，分析熒光漲落的相關函數而獲得單個粒子的濃度、化學動力學等參數信息。細胞膜上的脂筏富含膽固醇和鞘磷脂，是一個高度異質化和活躍的微小區域（<200nm），正是由于這一特點，使得其上的分子運動很難被觀察到。為了研究這一問題，Eggeling教授團隊構建了兩個熒光標記（Atto647N）的脂類分子，甘油磷脂（PE）和鞘磷脂(SM)，利用FCS來觀察這兩個分子在質膜上的運動方式。PE和SM在膜上聚集、運動方式不同，SM更加密集，以一個整體來運動，運動速率應該較慢；而PE則是以散落的形式，更自由、快速的運動。使用Confocal-FCS來觀察這兩者的運動差別，由于空間分辨率的不足，無法得出有效FCS數據來支持以上假設。Eggeling教授進而使用了可以提供更高空間分辨率的STED-FCS來進行觀察。分析結果表明PE在膜上是自由擴散，而SM會時不時被有膽固醇參與的“陷阱"捕獲而停止運動。線掃STED-FCS結果表明，SM被捕獲（trapping）的時間大概持續幾秒，且這種現象只有在空間分辨率高于80nm時才可觀察到。STED-FCS研究分子運動的方法可用于研究在免疫反應中T細胞的激活過程里脂類分子的運動機制和HIV病毒侵染宿主細胞后的Budding過程中的所涉及的脂類分子。
報告結束后，各位參會代表還前往丹納赫中國總部參觀了生命科學平臺的客戶體驗中心，了解了丹納赫在生命科學領域的多種解決方案。
整場活動內容精彩紛呈，通過親身感受，各位專家表現出對徠卡超高分辨率解決方案濃厚的興趣。同時，對于由于疫情原因未能親臨現場的老師，本次活動也提供現場直播的環節。現在，直播內容已經整理完畢，除了部分未發表數據應講者要求隱藏之外，其他內容均已可以在線回看。
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