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研域(上海)化學(xué)試劑有限公司
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ELISA測定技術(shù)的發(fā)展

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Elisa試驗(yàn)是一種敏感性高,特異性強(qiáng),重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存,操作簡便,結(jié)果判斷較客觀等因素,已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。然而,影響Elisa試驗(yàn)結(jié)果的因素很多,故加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。
一、Elisa試劑盒測定技術(shù)的發(fā)展
臨床測定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學(xué)的發(fā)展,而方法學(xué)的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進(jìn)步更新和型標(biāo)記物的應(yīng)用。目前,分子生物學(xué)正在并zui終肯定會(huì)讓我們對整個(gè)生命科學(xué)有一個(gè)全面而*的認(rèn)識(shí),其對免疫測定技術(shù)發(fā)展的影響也是直接而又有效的,它使我們對以前一些難以檢測的生物活性物質(zhì)的測定變得輕而易舉,并且大大提高了檢測的靈敏度和特異性。
1、基因工程試劑對免疫測定技術(shù) 發(fā)展的影響
免疫測定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng),所以任何的診斷試劑離不開的原料,如抗原抗體,酶等。以前用于免疫測定的抗原通常為各種純化抗原,而抗體則為純化抗原免疫動(dòng)物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術(shù)得到的單克隆抗體,而抗原或抗體的標(biāo)記物如酶標(biāo)結(jié)合物則通過各總化學(xué)合成方法制備。近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結(jié)合物等免疫測定試劑幾成為現(xiàn)實(shí)的新一代試劑,各種新型使用的測定方法也不斷出現(xiàn)。
HBsAg試劑特點(diǎn)(檢測模式:臨 床抗體夾心法):
包被抗體為山羊多抗,多抗具有高親和性和對抗原各種表位的反應(yīng)性。
酶表抗體為與HBsAg有不同結(jié)合位點(diǎn)的鼠復(fù)合單位。
可測得HBsAg變異樣品。
提高檢測的特異性(99.98%)
提高檢測的靈敏度,應(yīng)用Parl  Ehrich 學(xué)說(PEI)HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品,對ad標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度為0.05ng/ml對ay標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度為0.025ng/ml

2、基因工程
較早用于免疫測定的基因工程抗原是HBcAg和HBsAg,這兩種基因工程抗原的出現(xiàn),較好地解決了抗HBc和HBe的測定問題。因?yàn)橐獜牟《颈旧砣ゴ罅揩@取這兩種純抗原較為困難,并且這一點(diǎn)對于難培養(yǎng)的病原微生物來說,如HIV、HCV和梅毒螺旋體等都有些共性。
2.1 HCV-Elisa試劑
HCV目前尚不能體外培養(yǎng),只能用基因工程或化學(xué)合成方法獲取HCV結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)區(qū)的各種抗原片斷,已知HCV基因組有7個(gè)功能區(qū)組成:核心、E1、E2/NS1 NS2 NS3 NS4 NS5(有分為NS和NS5b)區(qū),合成抗原的優(yōu)點(diǎn)是易于純化,特異性好,抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)。
2.1.1*代抗HCV-Elisa試劑盒
-由美國ortho公司克隆C1003抗原幾個(gè)片斷與人超氧化物歧化酶(SOD)結(jié)合。用酵母從病毒基因組非結(jié)合區(qū)得到表達(dá),表達(dá)為融合蛋白,亦作為包被固相載體。
-抗原組合:NS4 區(qū)二個(gè)基因片斷為NS 5-1-1和C1003
-特性:IgG抗C100在發(fā)病后數(shù)月后,才檢出,故不宜作早期診斷。
-約由20%的病人不出現(xiàn)抗體。IgM抗-C100急性期檢出率只有64%。
-C100的抗原性較弱,在HCV復(fù)制中,不能充分暴露宿主的免疫系統(tǒng)。
-特異性和靈敏性較差。
2.1.2第二代HCV-ELISA試劑盒
-用基因重組的HCV結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白抗原包被固相載體。
-抗原組合:核心區(qū)(C區(qū))多肽C22  NS區(qū)多肽C33  C1003和NS 5-1-1
-增加C22區(qū)和C33區(qū)后,抗體出現(xiàn)早,有助早期診斷,提高陽性率。有利早期診斷。
-C22是早期易出現(xiàn)病毒血癥
2.1.3第三代HCV-ELISA試劑盒
人工合成多肽抗原,由36個(gè)氨基酸組成的Cp9(內(nèi)殼蛋白)和19個(gè)氨基酸組成Cp10混合包被固相載體。
抗原組合:除有C 100-3  C22  C33 外又增加了core 和NS  NS4  NS5
特點(diǎn):
      *core  NS3 NS5由Baculovirus 重組表達(dá),沒有非特異性的   載體,試劑特異性高 ,重組的蛋白經(jīng)融合形成大分子抗原,利于提高檢測靈敏度。
      * NS3 區(qū)增加了氨基酸片斷(比例十分重要)。改進(jìn)了反映的靈敏度。
      * NS5 經(jīng)優(yōu)化,徐去了非特異性的區(qū)域(G-D-D)NS NS5是血轉(zhuǎn)化zui早測得的抗體,提高了診斷的準(zhǔn)確性。
      * NS4 為倆個(gè)片斷的合成多肽,去掉了非特異性反應(yīng)的區(qū)域,加強(qiáng)了試劑的靈敏度和特異性。
2.1.4第四代HCV—ELISA 試劑盒
-美國新近推出一種包括HCV基因組7個(gè)功能區(qū)所有免疫決定基的單一融合蛋白,稱為多決定基融合抗原,采用表面活性劑處理分界病毒表面復(fù)合物,釋放HCV核心抗原(core)并用ELISA法,靈敏度可達(dá)500拷貝/ml,已接近核酸擴(kuò)增檢測水平。
-抗原組合:以Core和NS3作為主要檢測片斷(比例十分重要)加合成多肽NS4
-特點(diǎn):直接測Core抗原
             不易發(fā)生變異
             抗IgM 和IgG檢出率可達(dá)100%
             特異性達(dá)99.8%靈敏度為100%

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