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研域(上海)化學試劑有限公司資料大小
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大鼠血管生成素(Angiopoietin) ELISA 檢測試劑盒
本試劑僅供研究使用 標本:血清或血漿
試驗原理:
Angiopoietin試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA).已知Angiopoietin濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將Angiopoietin和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中Angiopoietin的濃度呈比例關系。
試劑盒內容及其配制
試劑盒成份(2-8℃保存) | 96孔配置 | 48孔配置 | 配制 |
96/48人份酶標板 | 1塊板(96T) | 半塊板(48T) | 即用型 |
塑料膜板蓋 | 1塊 | 半塊 | 即用型 |
標準品:800pg/ml | 1瓶(0.6ml) | 1瓶(0.3ml) | 按說明書進行稀稀 |
空白對照 | 1瓶(1.0ml) | 1瓶(0.5ml) | 即用型 |
標準品稀釋緩沖液 | 1瓶(5ml) | 1瓶(2.5ml) | 即用型 |
生物素標記的抗Angiopoietin抗體 | 1瓶(6ml) | 1瓶(3.0ml) | 即用型 |
親和鏈酶素-HRP | 1瓶(10ml) | 1瓶(5.0ml) | 即用型 |
洗滌緩沖液 | 1瓶(20ml) | 1瓶(10ml) | 按說明書進行稀釋 |
底物A | 1瓶(6.0ml) | 1瓶(3.0ml) | 即用型 |
底物B | 1瓶(6.0ml) | 1瓶(3.0ml) | 即用型 |
終止液 | 1瓶(6.0ml) | 1瓶(3.0ml) | 即用型 |
標本稀釋液 | 1瓶(12ml) | 1瓶(6.0ml) | 即用型 |
自備材料
1. 蒸餾水。
2. 加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3. 振蕩器及磁力攪拌器等。
安全性
1. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
2. 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
操作注意事項
1. 試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。
2. 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
3. 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6. 洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7. 底物A應揮發,避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
8. 加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9. 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
樣品收集、處理及保存方法
1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液
5、 保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
試劑的準備
1. 標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:
800 pg/ml | (6號標準品) | 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
400 pg/ml | (5號標準品) | 100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
200 pg/ml | (4號標準品) | 100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
100 pg/ml | (3號標準品) | 100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
50 pg/ml | (2號標準品) | 100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
25 pg/ml | (1號標準品) | 100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
0 pg/ml | (空白對照) | 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
2. 洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。
操作步驟
1. 使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產生加樣上的誤差。
2. 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定,能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應孔內。
3. 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
4. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
6. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
7. 每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
8. 取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結果。
9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。
建議使用的實驗方案
| 標準品濃度(pg/ml) | | ||||||||||
A | 800 | 800 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
B | 400 | 400 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
C | 200 | 200 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
D | 100 | 100 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
E | 50 | 50 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
F | 25 | 25 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
G | 0 | 0 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
H | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
局限
6號標準品以上的結果為非線性的,根據此標準曲線無法得到的結果。
試劑盒性能
1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2. 特異性:不與其它細胞因子反應。
3. 重復性:板內、板間變異系數均小于10%。
結果 判 斷 與 分 析
1、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的Angiopoietin標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的Angiopoietin含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
3、檢測值范圍:0-800pg/ml
4、敏感度: 1.0 pg/ml
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