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熒光標(biāo)記二抗的選擇-FITC/Rhodamine/Texas Red/Cy/PE/AMCA

一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團（FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于Western Blot和ELISA，zui常用的二抗是酶標(biāo)二抗；而細(xì)胞或組織標(biāo)記實驗（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用Biotin/Avidin檢測系統(tǒng)。其中熒光素是具有光致熒光特性的染料，熒光染料種類很多，目前常用于熒光標(biāo)記二抗有以下幾種：

【異硫氰酸熒光素-Fluorescein Isothiocyanate （FITC）熒光標(biāo)記二抗】

FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。FITC分子量為389.4，zui大吸收光波長為490～495nm，zui大發(fā)射光波長為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用zui廣泛的熒光素。由于FITC是小分子化合物，每一個抗體可標(biāo)記幾個FITC分子，IgM通常用小分子的熒光素標(biāo)記，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC熒光二抗主要優(yōu)點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。然而FITC的zui大缺點是淬滅快，因此要和抗淬滅劑一起使用。

【四甲基異硫氰酸羅丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate（TRITC），Rhodamine Red-X（RRX）, Texas Red（TR）熒光標(biāo)記二抗】

這些羅丹明的衍生物耦聯(lián)基團具有不同的吸收波長 （550, 570, 596nm）和zui大發(fā)射波長（570, 590, 620nm）。盡管TRITC經(jīng)常和FITC一起在雙標(biāo)記實驗中使用，使用RRX和TR可以得到更好的顏色區(qū)分。在使用裝有氪氬燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標(biāo)記的實驗時，RRX尤其有用，可以和Cy2（或者FITC）和Cy5一起使用，因為RRX的發(fā)射波長在Cy2和Cy5中間，而且和這兩者覆蓋都很少。氪氬燈激發(fā)光為488nm，598nm和647nm，分別是Cy2（FITC）, RRX和Cy5的理想激發(fā)波長。因為FITC和PE可以被氬燈的488nm波長激發(fā), 在流式細(xì)胞儀中用FITC作雙標(biāo)，另一種用藻紅蛋白（PE）耦聯(lián)基團要比羅丹明好。TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。zui大吸收光波長為 550nm，zui大發(fā)射光波長為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｒ蚱錈晒獯銣缏部捎糜趩为殬?biāo)記染色。

【菁類染料-Cyanine dyes（Cy2, Cy3, Cy5）】

Cy2耦聯(lián)基團激發(fā)波長為492nm，發(fā)光為波長510nm的綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC在光下更穩(wěn)定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑，因為這種抗淬滅劑和Cy2反應(yīng)，在染色片儲存后會導(dǎo)致熒光微弱和擴散。Cy3和Cy5比其他的熒光團探針要更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。Cy3耦聯(lián)基團激發(fā)光的zui大波長為550nm，zui強發(fā)射光為570nm。因為激發(fā)光和發(fā)射光波長很接近TRITC, 在熒光顯微鏡中，可使用和TRITC一樣的濾波片。

Cy3在氬光燈（514nm或528nm）下可以被激發(fā)出50％的光強，在氦氖燈（543nm）或者汞燈（546nm）下則約75％。Cy3可以和熒光素一起作雙標(biāo)。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實驗中作多標(biāo)記。Cy5耦聯(lián)基團的激發(fā)波長zui大650nm，發(fā)光波長zui大670nm。在氪氬燈（647nm）下它們可被激發(fā)出98％的熒光，在氦氖燈下（633nm）為63％。Cy5可以和很多其他的熒光基團一起用在多標(biāo)記的實驗中。由于它的zui大發(fā)射波長在670nm，Cy5很難用裸眼觀察，而且不能用汞燈作理想的激發(fā)。通常觀察Cy5時采用具有合適激發(fā)光和遠(yuǎn)紅外檢測器的共聚焦顯微鏡。在水相封片劑中應(yīng)當(dāng)加入抗淬滅劑。使用傳統(tǒng)的表面熒光顯微鏡時，不推薦使用Cy5。

【藻紅蛋白或藻膽色素蛋白-Phycoerythrin（PE）熒光標(biāo)記二抗】

存在于被稱為藻紅的多聚微粒中，位于葉綠素的反應(yīng)中心，在自然結(jié)構(gòu)中，藻紅蛋白吸收光能，吸收后轉(zhuǎn)化成能量，供其發(fā)育生長。當(dāng)藻紅蛋白被分離和純化后，其蛋白質(zhì)變得具有很強的熒光，能吸收不同波長的光，發(fā)出亮紅色的熒光，此時不再接受任何外來的光，也不能轉(zhuǎn)移光能。藻紅蛋白PE的吸收波長范圍較廣，zui大的吸收波長為566nm，zui大的發(fā)射波長為574nm。藻紅蛋白作為熒光標(biāo)記物具有以下優(yōu)點：首先具有強的長波長激發(fā)和發(fā)射熒光，可避免來自其他生物材料熒光的干擾；并且具有*的發(fā)射量子產(chǎn)率；另外PE具有非常高的水溶性而且與許多生物學(xué)或合成材料的多位點穩(wěn)定交聯(lián)。

【Aminomethylcoumarin Acetate （AMCA）】

耦聯(lián)的AMCA吸收光波長zui大為350nm，發(fā)熒光則為450nm。對于熒光顯微鏡來說，AMCA可以用汞燈來激發(fā)，用紫外濾板來觀察。由于AMCA的信號相對較弱，單標(biāo)實驗中不推薦使用AMCA。AMCA和熒光素的熒光波長只有很小的重疊范圍，而和發(fā)出長波長熒光的熒光基團沒有或者只有極少的重疊，因此它zui常用于多標(biāo)記實驗中，比如免疫熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀。由于人眼不能很好的檢測藍色熒光，在多標(biāo)記的實驗中，AMCA耦聯(lián)的二抗應(yīng)當(dāng)被用于檢測大量的抗原。AMCA和熒光素一樣很快淬滅，使用抗淬滅劑可以減輕。且由于肉眼不能很好的檢測AMCA所激發(fā)的藍色熒光，因而AMCA耦聯(lián)的二抗更適用于檢測大量存在的抗原。如果使用在流式細(xì)胞儀中，AMCA可以用汞燈或者水冷卻的氬光燈激發(fā)，因為它們發(fā)出的光線是在光譜的紫外區(qū)。

注：由于觀察熒光需要一定波長的激發(fā)光，必須根據(jù)實驗室已有的儀器可發(fā)光的波段進行選擇。另外，多標(biāo)記中對探針色彩區(qū)分程度的要求。例如，若丹明紅-X （RRX）和德克薩斯紅（TR）熒光素的區(qū)別就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的區(qū)別明顯。如果對靈敏度有更高的要求，則Cy3和Cy5就比其他的熒光團探針要亮。

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