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豬γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：0.8 ng/ml, - 50 ng/ml,

zui低檢測限：0.2 ng/ml,

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的豬IFN-γ，且與其他相關蛋白無交叉反應。

有效期：6個月

預期應用：ELISA法定量測定豬血清、血漿、細胞培養上清或其它相關生物液體中IFN-γ含量。

說明

l        試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

l        濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

l        中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

l        剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗IFN-γ抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗IFN-γ抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IFN-γ.呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.        酶聯板（Assay plate ）：                              一塊（96孔）。

2.        標準品（Standard）：                                2瓶（凍干品）。

3.        樣品稀釋液（Sample Diluent）：                          1×20ml/瓶。

4.        生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：        1×10ml/瓶。

5.        辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent）： 1×10ml/瓶。

6.        生物素標記抗體（Biotin-antibody）：            1×120μl/瓶（1：100）。

7.        辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：    1×120μl/瓶（1：100）。

8.        底物溶液（TMB Substrate）：                          1×10ml/瓶。

9.        濃洗滌液（Wash Buffer）：  1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.    終止液（Stop Solution）：                   1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供的試劑和器材

1.        標準規格酶標儀

2.        高速離心機

3.        電熱恒溫培養箱

4.        干凈的試管和Eppendof管

5.        系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6.    蒸餾水，容量瓶等

標本的采集及保存

1.        血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2.        血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

3.        細胞培養物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

標本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。

標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為50 ng/ml,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋50 ng/ml, 25 ng/ml, 125 ng/ml, 6.2 ng/ml, 3.1 ng/ml, 1.6 ng/ml, 0.8 ng/ml.，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml,，臨用前15分鐘內配制。

如配制25 ng/ml,標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）50 ng/ml,的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

生物素標記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標記抗體加990μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。

操作步驟

實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.        加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。

為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.        棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制），37℃,60分鐘。

3.        溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。

4.        每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。

5.        溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。

6.        依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.        依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

8.        用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。

實驗備注

l        用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。

l      每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測量時先用此孔調OD值至零。

l        為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。

l        未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標記親和素工作液。

l        建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算

以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項

l        底物請避光保存。

l        當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。

l        請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

l        洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

l        不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

l        一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

l        在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

l        如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。