目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC5975-100T/96S丁酰膽*酯酶活性檢測試劑盒 微量法
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100T/96S |
| 貨號 | BC5975 | 應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業 |
| 主要用途 | 丁酰膽*酯酶活性檢測 |
丁酰膽*酯酶（BchE）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC5975
規格：100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體125 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體12mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 試劑二：臨用前加入12mL試劑一，充分溶解，-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。
產品說明：
丁酰膽*酯酶（Butyrylcholinesterase，BchE，EC3.1.1.8），又稱血漿膽*酯酶，假性膽*酯酶，是一種*酸水解酶，由肝臟合成后進入血液，幾乎存在于所有動物組織中。BchE結構與乙酰膽*酯酶（AchE）相似，但底物特異性和抑制劑敏感性不同。與AchE相比，BchE能夠有效水解較大的膽*酯，如丁酰膽*和苯甲酰膽*，而且可以清除有機磷類農藥、氨基甲酸酯類農藥等神經毒劑的毒害作用。有研究表明，BchE可作為阿爾茨海默病治療的重要靶點。
BchE催化丁酰膽*水解生成膽*，膽*與二硫對硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巰基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm處有吸收峰，通過測定412nm吸光度增加速率，計算BchE活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、分析天平、水浴鍋/恒溫培養箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織樣本：按照組織質量（g）：試劑一體積（mL）=1：5~10比例加入試劑一（建議稱取0.1g樣本，加入1.0mL試劑一），冰浴勻漿后，于4℃，12000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。
2. 血清/血漿等液體樣本：直接測定。若有渾濁請離心后取上清置于冰上待測。
3. 細菌、細胞：按照細胞數量104個：試劑一體積（mL）500~1000:1的比例（建議500萬細胞加入1 mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3s，間隔7s，總時間3 min），于4℃，12000rpm離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。
二、 測定步驟
1．可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至412nm，分光光度計蒸餾水調零。
2．操作表：（在微量玻璃比色皿/96孔板中加入下列試劑）
試劑名稱（μL） | 測定管 | 空白管 |
樣本 | 10 | - |
蒸餾水 | - | 10 |
試劑二 | 100 | 100 |
試劑三 | 100 | 100 |
立即充分混勻后于412nm處測定10s時的吸光值A1，迅速置于37℃水浴或恒溫培養箱5min（酶標儀有控溫功能可將溫度調至37℃），拿出迅速擦干測定5min10s時的吸光值A2。計算ΔA測定=A測定2-A測定1，ΔA空白=A空白2-A空白1，ΔA=ΔA測定-ΔA空白。空白管只需測定1-2次。 | ||
三、BchE活性計算
A、用微量玻璃比色皿測定：
1. 按照蛋白濃度計算
活性單位定義：每mg蛋白每分鐘催化產生1nmol TNB為1個酶活單位。
BchE活性(U/mg prot)=[ΔA÷（ε×d）×V反總×109] ÷（Cpr×V樣）÷T×F=308.8×ΔA÷Cpr×F。
2. 按照樣本質量計算
活性單位定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol TNB為1個酶活單位。
BchE活性(U/g 質量)=[ΔA÷（ε×d）×V反總×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T×F=308.8×ΔA÷W×F。
3. 按照血清/血漿等液體體積計算
活性單位定義：每mL血清/血漿每分鐘催化產生1nmol TNB為1個酶活單位。
BchE活性(U/mL)=[ΔA÷（ε×d）×V反總×109]÷V樣÷T×F=308.8×ΔA×F。
4. 按細菌/細胞數量計算
活性單位定義：每萬個細胞每分鐘催化產生1nmol TNB為1個酶活單位。
BchE活性(U/104 cell)=[ΔA÷（ε×d）×V反總×109]÷（N×V樣÷V樣總）÷T×F=308.8×ΔA÷N×F
ε：TNB摩爾消光系數，13.6×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，0.21mL=2.1×10-4L；109：單位換算系數，1mol=1×109nmol；V樣：反應體系加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入試劑一體積，1mL；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，5min；F：樣本稀釋倍數；N：細菌/細胞數量，以萬計。
B、用96孔板測定：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm進行計算即可。
注意事項：
1. 為保證結果準確，請嚴格控制反應時間，建議兩人進行實驗，一人加樣，一人計時。
2. 如果?A測定接近?A空白，可以增加樣本量后再進行測定；如果A2測定大于1或ΔA測定大于0.7，建議將樣本上清用試劑一適當稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。
實驗實例：
1. 取0.1018g大鼠肝臟樣本，加入1mL試劑一進行冰浴勻漿，離心后上清液用試劑一稀釋2倍，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定2-A測定1=0.636-0.417=0.219，ΔA空白=A空白2-A空白1=0.188- 0.180= 0.008，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.211，按樣本質量計算得（光徑為0.6cm帶入計算）：
BchE活性（U/g 質量）=[ΔA÷（ε×d）×V反總×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T×F =2133.49 U/g 質量。
2. 取人血清樣本，用試劑一稀釋16倍，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A測定2-A測定1=0.960- 0.299=0.661，ΔA空白=A空白2-A空白1=0.188- 0.180=0.008，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.653，按液體體積計算得（光徑為0.6cm帶入計算）：
BchE活性（U/mL）=[ΔA÷（ε×d）×V反總×109]÷V樣÷T×F =5377.237 U/mL。
參考文獻：
[1] Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J]. Biochemical Pharmacology, 1961, 7(2): 88-95.
[2] Yücel YY, Tacal O, Ozer I. Comparative effects of cationic triarylmethane, phenoxazine and phenothiazine dyes on horse serum butyrylcholinesterase [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2008, 478(2): 201-205.
[3] Jońca J, ?uk M, Was?g B. et al. New Insights into Butyrylcholinesterase Activity Assay: Serum Dilution Factor as a Crucial Parameter [J]. PLoS ONE, 2015, 10(10).
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