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人外周血中性粒細胞分離液試劑盒   
貨號：P9040
規格：2×200ml/KIT
保存：室溫避光儲存，有效期少 2 年。

產品組成：
                   名稱              規格
                   試劑 A            200ml
                   紅細胞裂解液      100ml
                   全血及組織稀釋液  200ml
                   細胞洗滌液        200ml
 

注意事項：
     A．本實驗要求，在正常大氣壓下，分離液、分離樣本以及分離環境溫度為20℃±2℃。分離液在低溫時呈較高密度，在高溫時呈較低密度。細胞分離液從冰箱取出后，不可立即使用，操作前可將樣本和分離液復溫18-22℃。為獲得的實驗結果，好在取血后2小時內進行實驗，血液提取后存放時間越長細胞活性越低。
    B．實驗過程中，如需稀釋血液或洗滌細胞，不可使用含Ca 2+ 、Mg 2+ 離子的緩沖液及培養液，其成分會導致血細胞凝集，大大降低細胞得率及純度。
    C．優抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。注意在血液稀釋過程中去除抗凝劑體積。
    D．好使用無靜電反應的離心管，推薦使用未經過堿處理的玻璃離心管。
    E．由于各品牌離心機的性能不同，國內南北地區溫度環境和四季的差異，可能影響分離效果，用戶可以調節離心轉數和離心時間，摸索的分離條件（具體分離條件各實驗室自定）。
 

分離方法 ：
    1. 取1ml新鮮抗凝血，與全血及組織稀釋液1:1 混勻后小心加于1份A液之液面上；
    2. 以500g（約1800轉/分）離心25分鐘(半徑15cm水平轉子)。
    3. 此時離心管中由上下細胞分四層。*層：為血漿層。第二層：為環狀乳白色的單個核細胞層。
    第三層：為略帶混濁的分離液層（富集一定量的中性粒細胞）。第四層：為紅細胞層。棄去*層血漿層及第二層細胞，收集第三層分離液層和第四層紅細胞層，放入含細胞洗滌液10ml的試管中，充分混勻后，以500g約（1800轉/分）離心30分鐘。沉淀經1次洗滌后用紅細胞裂解液裂解紅細胞，再經3次洗滌去除紅細胞內溶物和碎片后取沉淀細胞即為所需中性粒細胞。
    注：A. 提取率約為80%。
    B. 紅細胞裂解過程詳見“紅細胞裂解液使用說明”。

紅細胞裂解液使用說明 ：
    本公司紅細胞裂解液在裂解紅細胞的同時不損傷并在一定程度上保護淋巴細胞(lymphocyte)或其它有細胞核的細胞，所獲得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態。另外，本裂解液中無DNA及RNA酶，配合細胞分離液使用所提細胞可廣泛用于細胞培養及分子生物學實驗。
    紅細胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也稱ACK Lysis Buffer，是一種用于從人或鼠等的血液或組織細胞樣品中裂解并去除無細胞核紅細胞的溶液。
    本裂解液不適用于有細胞核紅細胞的裂解，例如鳥或禽類的紅細胞。本裂解液經過無菌處理，處理過的血液或組織細胞樣品可以用于后續的原代培養、細胞融合以及核酸或蛋白的提取及各種常規的分析和檢測。

使用說明：
    A.  對于組織細胞樣品：
    a. 新鮮組織經過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當方法分散成細胞懸液，離心棄上清。
    b. 加入3-5倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細胞沉淀的體積為1ml，則加入3-5ml的紅細胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。
    c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。
    d. 如果發現紅細胞裂解不*，可以重復上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不會影響后續的一些檢測。
    e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養液，重懸沉淀，400-500g離心2-3分鐘，棄上清。可再重復1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應少為細胞沉淀體積的5倍。4℃離心效果更佳。
    f. 根據實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數等后續實驗。
    B.  對于組織細胞樣品無需洗滌的快速操作步驟：
    a. 新鮮組織經過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當方法分散成細胞懸液，離心棄上清。
    b. 對于0.2ml細胞沉淀加入1ml紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。本步驟在室溫或4度操作均可。
    c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養液，混勻。
    d. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。
    e. 如果發現紅細胞裂解不*，可以重復上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不會影響后續的一些檢測。
    f. 根據實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數等后續實驗。
注：對于常規步驟，多一步洗滌過程中的離心，但可以節省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，同時不需要大體積的離心管。快速步驟少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時需要大體積的離心管。
    C.  對于血液樣品：
    a. 取新鮮抗凝血，400-500g離心5分鐘，離心棄上清。
    b. 加入6-10倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細胞沉淀的體積為1ml，則加入6-10ml的紅細胞裂解液。 本步驟在室溫或4度操作均可。 注意： 對于鼠的血液， 裂解1-2分鐘已經足夠，對于人的外周血，宜延長裂解時間4-5分鐘，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解。
   c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。
   d. 如果發現紅細胞裂解不*，可以重復上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不會影響后續的一些檢測。
   e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養液，重懸沉淀，400-500g離心2-3分鐘，棄上清。可再重復1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應少為細胞沉淀體積的5倍。4℃離心效果更佳。
   f. 根據實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數等后續實驗。
注：對于微量或少量的血液樣品，可以在*步中不進行離心棄上清的操作，直接在第二步中加入10倍血液體積的紅細胞裂解液，并在室溫或4℃裂解4-5分鐘。對于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經足夠，對于人的外周血，宜延長裂解時間10分鐘，但通常不宜超過15分鐘，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解。后續步驟相同。
   D.  對于血液樣品無需洗滌的快速操作步驟：
   a. 每1ml新鮮抗凝血中加入10ml紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解4-5分鐘。本步驟在室溫或4度操作均可。注意：對于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經足夠，對于人的外周血，宜延長裂解時間10分鐘，但通常不宜超過15分鐘，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解。
   b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養液，混勻。
   c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。
   d. 如果發現紅細胞裂解不*，可以重復上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不會影響后續的一些檢測。
   e. 根據實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數等后續實驗。
      注：對于常規步驟，多一步洗滌過程的離心，但可以節省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，同時不需要大體積的離心管。快速步驟少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時需要大體積的離心管。

產品性能指標 ：

pH 7.0-7.5
滲透壓 280-340mOsmol/kg
內毒素 ≤0.5EU/ml
無菌 直接接種培養14 天后培養基澄清
澄明度及不溶性顆粒物 每50ml 溶液中含10µm 以上的不溶性微粒20 粒以下，
含25µm 以上的不溶性微粒5 粒以下

貯藏及保存期限 ：
    本分離液是敏光型的，應在18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置4℃保存，有效期一周，若保證無微生物污染，啟封后可置4℃長期保存。未啟封前保存溫度較低（10℃以下）時分離液易出現白色結晶，影響分離效果。

人外周血中性粒細胞分離液試劑盒 

參考文獻：
《miR-20a inhibits the killing effect of natural killer cells to cervical cancer cells by downregulating RUNX1》 作者:Suo-Yu Zhu,Qun-Ying Wu,Chen-Xia Zhang,Qiong Wang,Jing Ling,Xian-Ting Huang,Xia Sun,Ming Yuan,Dan Wu,Hua-Fang Yin 期刊:Biochemical and Biophysical Research Communications 影響因子:2.559 PMID:30249397