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應(yīng)用分享丨冷凍電鏡推進離子通道蛋白研究
離子通道是一類廣泛的蛋白復合物，作為細胞膜上的開口，離子通道使各種離子在細胞內(nèi)部和細胞外介質(zhì)之間交換并加以調(diào)節(jié)。這些通道在細胞維持和穩(wěn)態(tài)中起到了*的作用。離子通道的失調(diào)與大量的疾病（也稱為離子通道病）有關(guān)，包括癌癥、癡呆癥、糖尿病、哮喘等等。離子通道是藥物設(shè)計中的一大難題，主要原因在于其選擇性抑制劑的設(shè)計具有一定難度，藥物缺乏特異性會對其它關(guān)鍵的、結(jié)構(gòu)類似的離子通道產(chǎn)生負面影響。
冷凍電鏡圖
從膜面看 SARS-CoV-2 3a 離子通道在脂質(zhì)納米盤中的 2.9? 分辨率的模型。圖為David M. Kern 等人在脂質(zhì)納米盤中 SARS-CoV-2 3a 離子通道的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)圖，可在CC BY 4.0下使用。
作為膜蛋白，離子通道對傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)（如 X 射線晶體學）有一定的挑戰(zhàn)。首先，這些復合物往往（至少部分）依靠膜來維持它們的結(jié)構(gòu)，而將它們分離出來進行結(jié)晶會破壞它們的原始狀態(tài)。更關(guān)鍵的是，離子通道的不同構(gòu)象對藥物研發(fā)至關(guān)重要，因為它們揭示了離子通道的結(jié)合點以及過渡狀態(tài)。任何無法區(qū)分這些構(gòu)象的研究方法，都難以基于結(jié)構(gòu)進行藥物設(shè)計。
冷凍電鏡 (cryo-EM) 包含一系列技術(shù)，包括單顆粒分析、冷凍電子斷層掃描和微電子衍射。在離子通道的研究中，冷凍電鏡對嵌入納米盤中的通道蛋白復合物進行單顆粒分析。納米盤的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)模仿了細胞膜的形態(tài)，有助于保持離子通道的原始狀態(tài)。冷凍電鏡從不同角度對數(shù)以千計的樣品顆粒進行成像，然后對這些二維圖像進行三維重構(gòu)。由于圖像可以被分類和分組，離子通道的不同構(gòu)象可以被分離出來，并單獨進行分析和重構(gòu)，以獲得不同構(gòu)象的結(jié)構(gòu)。
冷凍電鏡的分辨率和質(zhì)量足以展現(xiàn)激動劑和拮抗劑分子與離子通道的結(jié)合，揭示了潛在治療受體的精確位置和構(gòu)象。以下是制藥公司利用冷凍電鏡技術(shù)研究離子通道、推進基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計的幾個例子：
經(jīng)典瞬時受體電位 (TRPC) 蛋白構(gòu)成了一個非特異性陽離子通道家族，與多種病理現(xiàn)象相關(guān)。盡管TRPC具有疾病治療潛力，但其結(jié)構(gòu)和作用機制在很大程度上仍然是未知的。Amgen公司的研究人員利用冷凍電鏡，不僅得到了 TRPC6 的高分辨率結(jié)構(gòu)，而且還確定了其與拮抗劑和激動劑結(jié)合狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。通過確定這些識別位點，Amgen公司為未來針對 TRPC 相關(guān)疾病的藥物設(shè)計鋪平了道路。
TRPC6 的電子密度圖 (A) 和疊加蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) (B) ，紫紅色為結(jié)合的激動劑。圖為 Yonghong Bai 等人的 TRPC6 通道藥理調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可在CC BY 4.0下使用。
電壓門控鈉離子 (Nav) 通道是藥物研究的一個關(guān)鍵領(lǐng)域，因為它不僅是毒素和治療劑的作用靶標，并且容易發(fā)生疾病突變。值得注意的是，該通道的突變與偏頭痛、癲癇、疼痛以及心臟和肌肉麻痹綜合征有關(guān)。然而，科學家對該通道的機械行為仍然知之甚少。基因泰克公司（羅氏集團）的研究人員利用冷凍電鏡研究了 Nav7 與 Protoxin II (ProTx2) 的相互作用。ProTx2 是一種從秘魯綠絨蛛中分離出來的通道拮抗劑。研究人員解析了激活和失活狀態(tài)下的 Nav1.7 結(jié)構(gòu)，為開發(fā)特異治療性的 Nav 拮抗劑提供了一個重要的起點。
冷凍電鏡清晰地展示了與 ProTx2 拮抗劑結(jié)合的激活態(tài)（藍色/紫紅色）和失活態(tài)（黑色）的 Nav1.7 離子通道之間的結(jié)構(gòu)差異。圖片基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 (PDB) 6N4R 和 6N4Q，采用 PyMOL創(chuàng)建。
上述研究成果表明，冷凍電鏡在解決長期疑難問題——膜結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能方面上有著巨大潛力。現(xiàn)在有越來越多采用冷凍電鏡測定的離子通道結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，這表明研究人員對于該技術(shù)的興趣和使用都在不斷增加。基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計不僅僅是跟隨這一趨勢，更多地指引了這一趨勢，其新研究成果將為下一代治療方法提供參考。
來源：蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（2020 年 9 月 10 日）