人基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP-7)ELISA試劑盒的操作步驟

背景[1-3]

人基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP-7)ELISA試劑盒采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法，用于體外定量分析人血清、血漿、細(xì)胞裂解液、唾液、尿液或細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-7的含量。

檢測(cè)原理：預(yù)先包被的抗體和檢測(cè)相抗體都是親和純化級(jí)的MMP-7多克隆抗體。檢測(cè)抗體經(jīng)生物素標(biāo)記。樣品和生物素標(biāo)記抗體先后加入酶標(biāo)板孔反應(yīng)后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素反應(yīng)；經(jīng)過(guò)PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的MMP-7呈正相關(guān)。

人基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP-7)ELISA試劑盒

基質(zhì)金屬蛋白酶是依賴鋅和鈣的內(nèi)肽酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。它們?cè)谠S多生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如胚胎發(fā)育、組織成型、復(fù)制、再生等。它們參與很多病理過(guò)程如關(guān)節(jié)炎、癌癥、心血管疾病。新合成MMPs的量主要由復(fù)制水平控制。MMPs的活性主要由酶原的活化和其抑制蛋白質(zhì)（TIMPs）所調(diào)節(jié)。MMP-7由正常和疾病組織的上皮細(xì)胞分泌。MMP-7可降解一系列基質(zhì)如Ⅳ型膠原，明膠，彈性蛋白和層聯(lián)蛋白。MMP-7還能激活UPA和前MMP-1,2,9。本試劑盒所用標(biāo)準(zhǔn)品為重組人MMP-7，包含250個(gè)氨基酸，分子量28KDa。所檢測(cè)MMP-7包括酶原和活性酶。

操作步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照隨貨說(shuō)明書中圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7.溫育：操作同3。

8.洗滌：操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)）。

11.測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。