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抗體生物素化標(biāo)記
最近更新時(shí)間：2011-3-10
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抗體的生物素化標(biāo)記
抗體的生物素化標(biāo)記,可使抗體或其它蛋白質(zhì)的ε-氨基通過手臂與?；纳锼毓矁r(jià)結(jié)合。其后，生物素化的分子可應(yīng)用酶標(biāo)-親和素或熒光染料-鏈霉親和素復(fù)合物來檢測。小分子的水溶性生物素對細(xì)菌蛋白鏈霉親和素具有高度親和力是本法的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)。
試劑及儀器
NHSB：N-羥基琥珀酰亞胺生物素
0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液，pH 8.0
雙蒸水（注意去除游離氨基），用以配制碳酸氫鈉緩沖液或硼酸緩沖液
DMSO（二甲亞砜，有毒試劑）
1 mol/L NH4Cl
疊氮鈉（有毒試劑）
10g/L牛血清白蛋白（W/W）PBS液
分子篩柱（如G25）
電磁攪拌器
透析袋（MW CO 8000）
鋁鉑
微量移液器
操作步驟
1．將待生物素化的蛋白質(zhì)用0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液（pH 8.0）或0.5 mol/L硼酸緩沖液（pH 8.6）稀釋到1mg/ml,一般實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的生物素化體積為1-2.5ml
2．交互用0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液（pH 8.0）或0.5 mol/L硼酸緩沖液（pH 8.6），對蛋白質(zhì)充分透析；
3．用1ml DMSO 溶解NHSB 1mg
4．向1ml蛋白質(zhì)溶液（即含蛋白質(zhì)1mg）加入120μl NHSB溶液（即含NHSB 120 μg）
5．在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2-4小時(shí)
6．加入9.6μL1 mol/L NH4Cl （每25 μg NHSB 加1 μl），在室溫下攪拌10分鐘
7．在4℃，對PBS充分透析，以除去游離的生物素
8．將樣品上1ml的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集1ml/管，蛋白質(zhì)在1-3ml之間洗下
9．zui后，樣品加入疊氮鈉（終濃度0.5g/L）及1.0g/L BSA。將結(jié)合產(chǎn)物置4℃，避光保存，亦可加入50%重蒸甘油，置―20℃保存。
質(zhì)量監(jiān)測
與酶-或熒光染料-結(jié)合的親和素、鏈霉親和素或中和親和素（neutravidin），通過標(biāo)準(zhǔn)方法（Western blotting 或免疫熒光染色法）測定交聯(lián)率。
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明
１．如在反應(yīng)混合液中有疊氮鈉或游離氨基存在，會抑制標(biāo)記反應(yīng)。因此，蛋白質(zhì)在反應(yīng)前要對0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液或0.5 mol/L硼酸緩沖液充分透析
２．所用的NHSB及待生物素化蛋白質(zhì)之間的分子比按蛋白質(zhì)表面的ε-氨基的密度會有所不同，選擇不當(dāng)則影響標(biāo)記的效率，應(yīng)先用幾個(gè)不同的分子比來篩選zui適條件
３．用NHSB量過量也是不利的，抗原的結(jié)合位點(diǎn)可能因此被封閉，導(dǎo)致抗體失活
４．由于抗體的氨基不易接近可能造成生物素化不足，此時(shí)可加入去污劑如Triton X-100,Tween 20等。
５．當(dāng)游離ε-氨基（賴氨酸殘基的氨基）存在于抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，或位于酶的催化位點(diǎn)時(shí)，生物素化會降低或損傷抗體蛋白的結(jié)合力或活性。此時(shí)，應(yīng)試用其它交聯(lián)方法
６．生物素還可能與不同的功能基團(tuán)，如羰基、氨基、巰基、異咪唑基及苯酚基，也可與糖基共價(jià)結(jié)合
７．交聯(lián)反應(yīng)后，應(yīng)充分透析，否則，殘余的生物素會對生物素化抗體與親和素的結(jié)合產(chǎn)生競爭作用
８．在細(xì)胞的熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，中和親和素的本底低，但由于鏈霉親和素含有少量正電荷，故對某些細(xì)胞可導(dǎo)致高本底