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綠色熒光蛋白-用途

最近更新時間：2011-5-5

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www.24590.cn/st175729/product_4537662.html在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域中，綠色螢光蛋白基因常被用作為一個報導(dǎo)基因（reporter gene）。一些經(jīng)修飾過的型式可作為生物探針，綠色螢光蛋白基因也可以克隆到脊椎動物（例如:兔子上進(jìn)行表現(xiàn)，并拿來映證某種假設(shè)的實(shí)驗(yàn)方法。

1．分子標(biāo)記
作為一種新型的報告基因，GFP已在生物學(xué)的許多研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。利用綠色熒光蛋白*的發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽（protein tagging），即利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后借助熒光顯微鏡便可對標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活體觀察。由于GFP相對較小，只有238個氨基酸，將其與其他蛋白融合后不影響自身的發(fā)光功能，利用GFP的這一特性已經(jīng)加深了我們對細(xì)胞內(nèi)一些過程的了解，如細(xì)胞分裂、染色體復(fù)制和分裂，發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。1996年，Ehrdardt等人報道了利用GFP的特性研究細(xì)胞分化蛋白FtsZ的定位。研究顯示FtsZ在細(xì)胞分裂位點(diǎn)形成了一個環(huán)狀物，且至少有9種蛋白在細(xì)胞分裂中起重要作用，盡管對這些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已經(jīng)搞清楚了它們聚合的順序以及在蛋白定位中的一些特征。利用GFP來檢測目標(biāo)蛋白的定位已為我們提供了一種對細(xì)胞內(nèi)的一些基本的生理過程進(jìn)行更詳盡觀察的新方法。
除用于特定蛋白的標(biāo)記定位外，GFP亦大量用于各種細(xì)胞器的標(biāo)記如細(xì)胞骨架、質(zhì)膜、細(xì)胞核等等。Shi等人曾報道將GFP融合到大腸桿菌細(xì)胞膜表面用作標(biāo)記蛋白，這一技術(shù)將有助于提高多肽庫的篩選效率、疫苗的研制、構(gòu)建細(xì)胞生物傳感器用作環(huán)境檢測以及探測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等等。這些都為傳統(tǒng)生物學(xué)研究提供了新思路和新方法，成為交叉學(xué)科研究的熱點(diǎn)。
2．藥物篩選
許多新發(fā)展的光學(xué)分析方法已經(jīng)開始利用活體細(xì)胞來進(jìn)行藥物篩選，這一技術(shù)能從數(shù)量眾多的化合物中快速篩選出我們所感興趣的藥物。基于細(xì)胞的熒光分析可分為三類：即根據(jù)熒光的密度變化、能量轉(zhuǎn)移或熒光探針的分布來研究目標(biāo)蛋白如受體、離子通道或酶的狀態(tài)的變化。熒光探針分布是利用信號傳導(dǎo)中信號分子的遷移功能，將一熒光蛋白與信號分子相偶聯(lián)，根據(jù)熒光蛋白的分布情況即可推斷信號分子的遷移狀況，并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小，在活細(xì)胞內(nèi)可溶且對細(xì)胞毒性較小，因而常用作熒光探針。
在細(xì)胞體內(nèi)分子之間的相互作用非常復(fù)雜，其中很多涉及到信號分子在細(xì)胞器之間的遷移。例如當(dāng)信號分子和某一特殊受體結(jié)合后常會導(dǎo)致配體-受體復(fù)合物從某一細(xì)胞區(qū)域遷移到另一區(qū)域，而這一遷移過程通常會介導(dǎo)一重要的生理功能。因而，這些受體常常被用作藥物篩選的目標(biāo)，若某一藥物具有與信號分子類似的功能，那么該藥物即具有潛在的醫(yī)藥價值。利用GFP熒光探針，將很容易從數(shù)量眾多的化合物中判斷出那些化合物具有與信號分子相似的能引起配體一受體復(fù)合物遷移并介導(dǎo)生理反應(yīng)的功能，且這一篩選過程簡單方便，所需成本也很低。利用這一原理，已經(jīng)成功構(gòu)建了一個篩選模型用于研究藥物介導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素受體（hGR）的遷移過程。在一96孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，并以一編碼hGR GFP蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞用待篩選的藥物處理后，hGR-GFP從細(xì)胞質(zhì)遷移人細(xì)胞核的過程可實(shí)時或在某一時段內(nèi)被證實(shí)，根據(jù)熒光分布即可推斷哪一種藥物具有與hGR配體相類似的功能。利用GFP來進(jìn)行藥物篩選由于受其必須與遷移的信號分子相偶聯(lián)，其篩選容量相對較低，但是由于GFP在細(xì)胞內(nèi)的穿透性強(qiáng)及*的發(fā)光機(jī)制，因而在藥物篩選中具有相當(dāng)大的應(yīng)用潛力。

3．融合抗體
近二十年來，抗體生成技術(shù)有了飛速發(fā)展，已經(jīng)從細(xì)胞工程抗體（雜交瘤技術(shù)一單克隆抗體）發(fā)展到了第三代抗體：基因工程抗體，尤其是噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)，解決了人源抗體的研制問題，促進(jìn)了各種性能優(yōu)良抗體以及具有多種功能的抗體融合蛋白的開發(fā)。單鏈抗體（Single-chain variable fragment，ScFv）是研究得較多的一種小分子抗體，其*陛在于可在宿主細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，易于基因工程操作，尤其易于構(gòu)建抗體融合蛋白。近年來，關(guān)于綠色熒光蛋白融合單鏈抗體的報道很多，國內(nèi)也有相關(guān)報道，如程虹等報道將抗肝癌單鏈雙功能抗體融合GFP真核表達(dá)載體并導(dǎo)人小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3表達(dá)并獲得成功。因融合抗體具有與抗原結(jié)合及發(fā)射熒光兩種特性，故這一人工分子可用做免疫染色的檢測試劑，直接應(yīng)用于流式細(xì)胞儀和免疫熒光的標(biāo)記及腫瘤的檢測等等。
由于技術(shù)上的的原因，一般融合抗體均置于原核表達(dá)系統(tǒng)如E.coli中表達(dá)。為便于表達(dá)蛋白的分離純化，一般在單鏈抗體的N端或C端插入一6×His序列，便于用Ni-NTA親和層析柱純化目標(biāo)蛋白。但這一技術(shù)也存在一些問題。由于抗體分子內(nèi)存在二硫鍵，而在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)由于抗體不能正確折疊，容易形成包涵體，表達(dá)出來的目標(biāo)蛋白無活性，需要在氧化還原體系中進(jìn)行復(fù)性。但近來也有報道在動物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中成功表達(dá)出具有抗原結(jié)合活性的單鏈抗體。若能成功解決融合抗體的表達(dá)問題，則在免疫染色及腫瘤檢測這一領(lǐng)域融合抗體將扮演極為重要的角色。
4．生物傳感器
蛋白質(zhì)工程技術(shù)已經(jīng)開始采用將一具有信號傳導(dǎo)功能分子識別位點(diǎn)的分子結(jié)合到另一分子上來設(shè)計(jì)生物感受器。綠色熒光蛋白由于其*的光信號傳導(dǎo)機(jī)制，以及在表達(dá)后易被周圍化學(xué)環(huán)境和蛋白之間的相互作用所影響的特性，因而極適于用做活細(xì)胞體內(nèi)的光學(xué)感受器。*個基于GFP的生物感受器為Ca2+感受器，由Romoser和Miyawaki幾乎同時提出。這一感受器原理是利用鈣調(diào)蛋白結(jié)合鈣離子后引起的空間構(gòu)象變化導(dǎo)致兩種GFP突變體間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。但是由于大多數(shù)蛋白不能像鈣調(diào)蛋白那樣承受較大的空間構(gòu)象變化，為克服這一缺點(diǎn)，人們開始提出利用基因融合技術(shù)將一新的分子識別位點(diǎn)結(jié)合到GFP上以構(gòu)建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根據(jù)這一原理將TEM1 β-內(nèi)酰胺酶（Bla）融合到GFP上。當(dāng)缺少目標(biāo)分子時，GFP處于靜止?fàn)顟B(tài)不會產(chǎn)生熒光。但是當(dāng)目標(biāo)分子β-內(nèi)酰胺酶抑制蛋白（BLIP）與Bla結(jié)合后，即使GFP活化產(chǎn)生熒光，而這一變化很容易被檢測到。將受體蛋白插入到GFP表面的技術(shù)已經(jīng)成為構(gòu)建分子感受器的有力工具，這種GFP感受器能被用來檢測多種分子，如蛋白質(zhì)、核酸、激素、藥物、金屬及其他的一些小分子化合物等，其潛在應(yīng)用前景極為廣闊。

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