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ELISA的基本原理-抗原抗體的免疫化學
點擊次數：2531 發布時間：2011-3-2
ELISA的基本原理
酶聯免疫吸附試驗（ELISA）顧名思義就是以酶作為標記指示物、以抗原抗體免疫反應為
基礎的固相吸附測定方法。因此，一個ELISA測定試劑，其有機組成部分包括三個方面，即固相支持物及包被的抗原或抗體、酶標記的抗體或抗原和酶反應底物等。抗原或抗體的固相化并不影響其免疫結合活性，酶標記的抗體或抗原亦是如此，并且標記酶的活性不因標記過程而喪失。整個測定中，抗原抗體結合反應在固相支持物上進行，反應結果的判斷以酶與其底物作用后的顯色或產生熒光或發光反應為準則，顯色或產生熒光或發光的強度與臨床標本中待測物的濃度成正比或反比關系。目前國內的ELISA試劑盒均以酶的顯色反應來完成測定。
固相上抗原抗體相互作用的免疫化學
固相上抗原抗體結合反應所需要的時間 通常，固相免疫測定如ELISA中抗原抗體結合達到平衡所需要的時間，要大于液相免疫測定，并隨液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比的增加而增加。當在微孑L板孔內進行免疫測定時，界面反應動力學顯示其對擴散作用有很強的依賴性，擴散性越強則反應所需時間越短，結合越充分。這一點可通過旋轉振蕩來達到，微孔的旋轉振蕩可促使液體進入到可與抗體或抗原包被界面接觸的較小的區域內。也可在微孔中放一個惰性的塞子以使反應液體成為一個小體積，或使用一個具有大表面的多孔的基質如硝酸纖維素，或使用微顆粒來做到這一點。微顆粒小于lum時，在測定時即成膠體懸液，而當顆粒或珠較大時，則會在沒有振蕩時，由于重力的作用而分開。所有上述方法均是通過減少液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比，從而減少固相免疫測定的擴散依賴性。
反應體積 此處的反應體積并非是微孔中的液體體積，而是固相免疫測定中與固相包被的抗體或抗原有接觸的部分，這部分體積到底有多少，很難測定，但比反應管中總液體體積要少得多。固相抗原抗體反應發生于液體—固相界面，可能處于一級結合鍵的引力距離內，小于10nm。液相中待測抗原或抗體要進入到這個結合界面，需要擴散或質量轉移。微顆粒的反應表面區域較微孑L要大得多，因而處于抗原抗體結合界面的體積占總反應體積的比例亦高得多。因此，結合反應的效率更高。這也是全自動化免疫測定分析儀均采用微顆粒固相的重要原因之一。可參與結合反應的抗體或抗原的濃度取決于可參與結合的反應體積，這無法計算。這一點使得使用通常的質量作用定律圖形的Keq的計算變得復雜化，因此，固相抗原抗體反應的KeQ值與液相抗原抗體反應的Keq值沒有可比性。
微孔內特異抗體的免疫測定 使用吸附的復雜抗原進行微孔內特異抗體的免疫測定，
與液相測定相比，有明顯的親和力依賴性，固相受體—配體相互作用的穩定性似乎與微孔內特異抗體的免疫測定親和力依賴性和極低比例的所捕獲的總抗體相矛盾