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PCR反應的基本原理與實驗步驟

時間:2023/9/27閱讀:1310
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一、實驗目的: 掌握PCR反應的基本原理與實驗技術

二、PCR反應實驗原理
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈式反應,可以選擇性擴增一段DNA序列。其基本步驟是,首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈,DNA樣品中,特異性的引物能夠與其互補的序列雜交,在dNTPs和Taq酶存在時,就可以合成模板DNA的互補鏈,反應完成后,將反應混合物加熱使DNA雙鏈變性,溫度下降后,過量的引物又可以開始第二輪的合成反應。這種延伸-變性-退火-延伸的循環可以重復多次,使所需要的DNA片段得到特異性的擴增。
1. 變性:加熱使模板DNA在高溫下(94℃)變性,雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈.
2. 退火:使溶液溫度降至50~60℃,模板DNA與引物按堿基配對原則互補結合.
3. 延伸:溶液反應溫度升至72℃,耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,在引物的引導下,利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸(dNTPs),按5ˊ→3ˊ方向復制出互補DNA。

上述3步為一個循環,即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講,每經過一個循環,樣本中的DNA量應該增加一倍,新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板,經過25~30個循環后DNA可擴增106~109倍。
   
典型的PCR反應體系由如下組分組成:DNA模板、反應緩沖液、dNTPs、MgCl2、兩個合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。

三、 試劑和緩沖液
PCR mix,10×PCR Buffer,引物,模板。

四、 儀器耗材
PCR儀,掌上離心機,微量移液器,槍頭,1.5mL離心管,PCR管,冰盒。

五、 實驗步驟(每人一組,每人做1管,純化時兩人一組)
1. 查找基因序列,設計合成PCR引物。注意合成引物約需一周時間,請提前準備。詳細步驟請參考實驗一后面的附件內容。
2. 在50μL反應體系中,加入:
    模板DNA (5ng/μL)        1   
    引物P1P2 (10μmol/L)    各1   
    2×PCR mix              25 
    ddH2O                  22 
在冰上配制,注意混勻后離心。加入10μL石蠟油覆蓋。
3. 在PCR儀中預變性94℃ 4min,然后循環:94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 60s,30個循環;循環結束后,72℃10min 。擴增的PCR產物4℃保存。(OC-II)
4. 取PCR產物2-5μL與上樣緩沖液混合,點樣。
5. 1% 瓊脂糖膠電泳,160V 30-40min。
6. 電泳結束,溴化乙錠染色5-10分鐘。
7. 用凝膠成像儀觀察、拍照。
8. PCR產物切膠回收。步驟參見膠回收Kit說明書。

A 酶切片段的純化及其回收
使用切膠回收kit進行PCR產物的回收。具體操作步驟如下,詳見說明書。
1)稱回收的膠,每0.1g加100µL XP2 ;
2)55度5-7分鐘至溶膠 ;
3)取溶膠液加入回收柱子,最大體積700µL;10000g, 1min;
4) 加300µl XP2 ,10000g 1min;
5)加700µl SPW ,10000g 1min;
6)重復5);
7)空管離心2min,13000 g
8)干燥,加15-30µL  Eulation Buffer
9)13000 g,1min

DNA產物純化kit,操作步驟:
● 將PCR反應液(40ul)或酶促反應液移至一干凈的1.5ml離心管中,加入5倍體積的buffer3,充分混勻。(用前確定加入適量的異丙醇)
● 將混合液全部移入吸附柱,8000g離心30s;將濾出液再次加入到吸附柱中再次過柱,8000g離心30s(此步驟可以提高回收效率);倒掉收集管中的液體,將吸附柱放入同一收集管中。
● 向吸附柱中加入500ul Wash Solution(加到壁上),9000g離心30s。倒掉收集管中的液體,將吸附柱放入同一收集管中。(Wash Solution使用前請檢查是否已加入正確量的無水乙醇)
● 重復步驟3一次
● 將空吸附柱和收集管放入離心機,9000g離心1min。下管扔掉,上管放入1.5ml離心管中,晾干。(殘余的乙醇會嚴重影響得率和后續試驗)
● 在吸附膜中央加入25ul 60℃提前預熱(進一步提高得率)的Elution Buffer(加到濾芯上),室溫靜置1min,9000g離心1min。將所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后續試驗。 注意:本步驟中,所有轉速單位為g。

B 乙醇沉淀法
也可以使用乙醇沉淀法對PCR產物回收。具體操作步驟如下。
● 加入等體積的冰無水乙醇,加入1/10體積的KAc(3M  pH5.2)。
● 上下顛倒混勻,-20℃30min;12000r/min 4℃ 10min。
● 棄上清,加入70%的冰乙醇,輕輕混勻。12000r/min 4℃離心10min。
● 棄上清,室溫干燥,至無乙醇。
● 加入適量體積的ddH2O。

六、注意事項
1. 進行PCR反應時,注意加入試劑的順序。注意加入任何一種試劑后均需混勻。
2. 本實驗使用2xPCR mix,包含有dNTPs和Taq酶。
3. 引物的稀釋:分子量24bp*324.5 = 7788,質量數10OD*33 =33ug,摩爾數=33/7788 =4.2 nmol,母液濃度4.2 n mol / 84μL H2O = 50μmol/L,使用時取母液稀釋5倍,則終濃度為10μmol/L。
4. PCR擴增產物共20μL,其中2-5 μL用于檢測,剩余的用于純化回收。
5. 使用自己的實驗材料進行PCR擴增的學生,請提前準備引物和模板。

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