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ELISA法檢測HIV抗體的影響因素
閱讀：842 發布時間：2022-12-5酶聯免疫吸附實驗（ELISA）是一種常用的固相免疫測定方法，被廣泛應用于各種抗原和抗體的測定。《全國艾滋病檢測技術規范》（2009年修訂版）中要求：各篩查實驗室在進行抗體檢測時，先用第一種篩查試劑（高敏感性ELISA）檢測，出現陰性反應報告“HIV抗體陰性"，出現陽性反應時不可直接報告陽性結果，則用另一種不同原理或不同廠家的篩查試劑（高特異性ELISA）復檢，所以ELISA法目前普遍用于艾滋病病毒抗體（HIV抗體）初篩實驗室用于HIV抗體的測定，但ELISA測定中影響因素較多，而且對檢驗人員的操作技術要求也較高，因此，為了得到準確可靠的檢驗結果，必須對ELISA法中的諸多影響因素采取相應的控制措施。目前，HIV抗體初篩實驗室常用的是血液標本。血液標本常見的干擾因素有內源性干擾和外源性干擾。
內源性干擾因素：包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體等，這些因素的存在，常使結果出現假陰性或假陽性等偏差，針對這些問題，解決辦法：（1）用0.01mol/L，pH7.2PBS（磷酸鹽緩沖液）將標本做1:1稀釋；（2）溫度56℃、時間30min將血清滅活。
外源性干擾因素：外源性干擾物質常常是由于血液標本在采集、保存、運送等過程中操作不當所造成，比如標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存時間久、標本凝集不全或加入抗凝血物質等。針對這些問題，解決辦法：（1）盡量避免樣品溶血；（2）標本采集后應室溫下自然防置1h～2h，待血液凝固、xue塊收縮后再用1500~3000r/min離心15min，吸出血清；（3）血清標本應立即進行測定，對于不能立即測定的標本，需2℃~8℃保存，超過一周以上測定的標本應-20℃以下保存；（4）標本中加入抗凝物質時，盡量避免使用酶抑制劑，以免造成對ELISA中酶活性的影響。
試劑的選擇：應使用經國家食品藥品監督管理局注冊批準的、敏感性高、特異性好的試劑；更換試劑批號時，應進行平行試驗；試劑盒嚴格控制在有效期內使用。
試劑的預處理：在ELISA法測定時試劑的預處理非常關鍵，也是較容易忽略的一個步驟，具體的做法：每次試驗前，將試劑盒從冰箱內取出，室溫下放置20min～30min，使試劑盒在使用前與室溫基本平衡一致，以免影響到抗原抗體的結合與反應的速度。
溫度：是ELISA法測定中最為重要的一個問題，它直接決定著試驗的成敗，所以在HIV抗體測定中一定要注意溫度的控制。ELISA以酶催化底物顯色來判斷結果，而抗原與抗體的合和酶催化底物的效率均與溫度密切相關，溫度高，顯色深，S/CO值高，反之，顯色淺，S/CO值低，影響結果的準確性。
在日常實際操作時，常忽略從室溫平衡的溫度逐步上升到37℃需要17min。為保證37℃下有足夠的反應時間，各實驗室可自行確定本實驗室不同季節微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長時間孔內溫度才能達到37℃，從而適當延長反應板在恒溫箱中的放置時間。具體的做法是，用一小溫度計單獨放置在非檢測樣品的空白板孔溶液中測量觀察。
加樣操作：加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標板孔底部，盡量不要觸及孔壁，加完后輕輕晃動混勻，并在酶標板上加覆膜。
洗滌與浸泡：反應板的洗滌次數及浸泡時間的長短，也直接影響著檢測結果，一般洗滌5～6次，浸泡時間每次為50s，洗滌次數過多或過少、浸泡時間過長或過短容易造成假陰性或假陽性。
酶標儀讀板：每次測定標本吸光度前，要將酶標儀開機預熱不低于20min，而且要在15min
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室內質控品：是非試劑盒組份的外部質控品，用來判斷本次實驗樣品檢測的有效性。可以是商品或實驗室自行制備。以該試劑盒臨界值（Cut-off）的2-3倍為宜。每次試驗必須包含室內質控品，其結果無效，必須重新實驗。
對于我們每一位檢驗人員來說，不管是檢驗標本，還是檢驗試劑、試驗溫度、儀器設備等等，只要把握好每個環節，就可以消除ELISA法在檢測HIV抗體中的諸多影響因素，就能保證為每位檢測者提供準確可靠的檢測結果。