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ELISA技術綜述（四）
閱讀：583 發布時間：2023-5-292.4 結合物的保存
酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質，保存不當，極易失活。高濃度的結合物較為穩 定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經復溶，頗為不便。結合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普 通冰箱的冰格中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結合物一般均按以上兩種形式供應，配以稀釋液（見3.2.5）臨用時按標明的稀釋度稀釋成工作 液。現在較先進的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達6個月。由于蛋白質濃度較低，結合物易失活， 需加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉），以防止細菌生長。
2.5 結合物的稀釋液
用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關蛋白質（例如1%牛血清白蛋白）， 通過競爭以抑制結合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時， 血清標本需稀釋后進行測定，也可應用這種稀釋液。
3. 酶的底物
3.1HRP的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應，具代表性的過氧化物為H2O2，其反應式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯 二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和 ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的產物呈橙紅 色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。 曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩定，須現配置現用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般 分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸 餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液，只需加入OPD后即可作為底物應用液。
TMB經HRP作用后共產物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另 外，TMB又有無致癌性等優點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸 收波長為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。
另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經HRP作用后，產物顯熒光，可用熒光光度計測量。用于ELISA的優點為可加寬定量測定的線性范圍。
HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應用最多，但尿素過氧化物為 固體，作為試劑較H2O2方便、穩定。試劑盒供應尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩定1年。
3.2 AP的底物
AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產物為黃色 的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩定一時間。AP也有發熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光 測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。
4. 洗滌液
在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。
5. 酶反應終止液
常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
6. 陽性對照品和陰性對照品
陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對 照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定，對照品最好也為人血清，因為正常人血清在各種 ELISA模式中可產生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復鈣人血漿 (recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相 似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質，其中加入一定量的待檢物質，此量最好在試劑說明書中標明。加入的量應與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較， 可對標本中受檢物質的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。 在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。
7. 參考標準品
定量測定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。