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“上海恒遠“文獻:靜電紡絲納米纖維的制備及其蛋白藥物緩釋體系
閱讀：485 發(fā)布時間：2019-8-30靜電紡絲納米纖維的制備及其蛋白藥物緩釋體系
顧珊珊，張寒瑩，朱嗣文，吳 飛，金 拓*
(上海交通大學藥學院，上海 200240)
摘要 ：細胞因子蛋白復雜脆弱的構(gòu)象極易因組織工程支架制備過程中的苛刻條件變性而失活，甚至引起有害的抗體反應。目前有關(guān)組織工程支架材料的研究方法尚未實現(xiàn)以天然構(gòu)象長期緩釋細胞因子蛋白。針對這個難題，本研究運用水相 - 水相冷凍相分離蛋白顆粒制備法，將蛋白藥物血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF165) 保護性載入葡聚糖納米顆粒中，進而將載有蛋白的多糖顆粒混懸于作為緩釋基質(zhì)的聚乳酸 - 羥基乙酸共聚物 (PLGA) 中，通過高壓靜電紡絲，制得長效緩釋VEGF165 的組織工程纖維膜。一系列物理化學表征，包括掃描電鏡 (SEM)、接觸角、強度試驗等，表明上述方法制得了表面形態(tài)與機械強度較理想的組織工程纖維。對制備過程中各個階段的蛋白進行回收，并采用 CCK-8 法進行活性檢測證明 VEGF165 的生物活性在多糖顆粒制備階段保持在 97％以上，在終的組織工程纖維膜階段保持在 87％以上，遠大于w/o 型乳液法制備得到的纖維 ( 低于 55％ )。體外試驗證明顆粒復合纖維能抑制蛋白突釋且達到長效緩釋效果，蛋白在初始 5 d 內(nèi)的釋放總量不到 35％，到 25 d 時釋放量超過 92％。而 w/o 型乳液法制得的纖維在初始 5 d 內(nèi)的釋放總量超過53.12％，到 25 d 時釋放量為 84.52％。后將纖維膜植入下肢缺血的大鼠體內(nèi)，進行免疫組化觀察，結(jié)果表明顆粒復合PLGA 纖維的再生血管數(shù)量明顯高于 w/o 型乳液法制備得到的纖維。
關(guān)鍵詞：靜電紡絲；蛋白；緩釋；血管內(nèi)皮生長因子；血管再生
中圖分類號：R944.9 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8255(2017)09-1325-07
靜電紡絲技術(shù)是一種纖維工藝，在高壓電場的作用下，聚合物溶液或熔體進行噴射紡絲，一般所得的納米纖維直徑在 2 nm 到幾微米之間 [1]。靜電紡絲纖維具有類似細胞外基質(zhì) (extracellular matrix，ECM) 的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能較好地模擬天然 ECM，從而提供細胞生長所需的微環(huán)境，在組織工程支架制備方面具有*的優(yōu)勢 [2]。聚乳酸 -羥基乙酸共聚物 (PLGA) 是人工合成的高分子材料，具有良好的機械性，可加工成管狀支架結(jié)構(gòu)，生物相容性好并可*降解，因而成為組織工程材料中研究應用廣的支架材料 [3]。細胞因子蛋白復雜脆弱的構(gòu)象極易因組織工程支架制備過程中的苛刻條件變性而失活，甚至引起有害的抗體反應。目前有關(guān)組織工程支架材料的研究方法尚未實現(xiàn)以天然構(gòu)象長期緩釋細胞因子蛋白。并且，有關(guān)載有生物活性因子的靜電紡絲組織工程支架的制備方法中，普遍存在蛋白藥物的體外突釋嚴重，蛋白藥物容易受到水油界面影響而變性失活，達不到理想的緩釋效果。本課題通過前期發(fā)明的無油水界面的水相 - 水相冷凍相分離方法 [4]，根據(jù)熱力學分配原理將血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF165) 包裹至葡聚糖 (DEX)納米顆粒中采用靜電紡絲的技術(shù)，巧妙地將VEGF165-DEX 納米顆粒與 PLGA 高聚物溶液混合，制得擔載 VEGF165-DEX 納米顆粒的 PLGA 納米纖維膜，并對纖維膜的表觀形態(tài)和物理性質(zhì)進行測定，同時利用 CCK-8 法考察了在纖維和顆粒制備過程中蛋白的活性變化，ELISA 試劑盒檢測體外釋放過程中蛋白的緩釋效果，此外還構(gòu)建了大鼠下肢缺血模型，考察納米纖維膜的治療效果。
1 儀器與試藥
ss-2534H 型靜電紡絲儀 ( 北京永康樂業(yè)科技有限公司)；S-4800 型掃描電鏡 ( 日本 Hitachi 公司 ) ；Alpha1-4型冷凍干燥機 ( 德國 Christ 公司 ) ；MK3 型酶標儀 ( 芬蘭Thermo Labsystem 公司 ) ；Instron5543 型生物力學測試機( 英國特朗公司 ) ；OCA20 型視頻光學接觸角測量儀 ( 德國Dataphysics 公司 ) ；Eclipse 倒置熒光顯微鏡 ( 日本尼康公司)；PM33GT-17 型壓汞儀 ( 美國 Quantachrome 公司 )。PLGA(75/25，MW 66 000 ～ 107 000，美國 Lakeshore Biomaterials 公司 ) ；小鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子 (murine VEGF165，型號 450-32) 和 murine VEGF ELISA kit( 型號900-K99)( 美國 PeproTech 公司 ) ；牛血清白蛋白 (BSA，進口分裝，上海思吉生物有限公司 ) ；0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液 (PBS，pH 7.4，賽默飛世爾生物化學制品有限公司 ) ；CCK-8 試劑盒 ( 日本同仁化學研究所 ) ；DEX(MW 64 000 ～76 000) 和聚乙二醇 6000(PEG 6000) ( 美國 Sigma 公司 ) ；N,N- 二甲基甲酰胺 (DMF)、二氯甲烷和Span-80( 化學純 ) 均購自國藥集團化學試劑有限公司 ；水合氯醛 ( 上海恒遠生物科技有限公司 ) ；多聚甲醛、山羊抗鼠 CD31、RP 標記的兔抗山羊均購自于谷歌生物上海實驗服務中心。人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (HUVECs，中國科學院細胞庫 )。Wistar 大鼠 ( 雄性，170 g，上海杰思捷實驗動物有限公司，合格證編號 2015000511432)。