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恒遠產品文獻:星形膠質細胞在降鈣素中樞鎮痛 機制中的作用 *
閱讀：460 發布時間：2019-11-22星形膠質細胞在降鈣素中樞鎮痛機制中的作用 *
李海英 1 △ 肖 智 2 △ 李樹法 3向 菲 4 王 青 1
（1 貴陽市第yi人民醫院內分泌科，貴陽 550002；2 遵義醫學院醫學與生物學研究中心，遵義 563003；3 臨沂市人民醫院內分泌科，臨沂 276000；4 貴陽市第二人民醫院內分泌科，貴陽 550081）
摘 要 目的：觀察降鈣素（sCT）對神經病理性疼痛大鼠中腦導水管周圍灰質（PAG）星形膠質細胞 D-絲氨酸（D-Ser）釋放的影響，明確星形膠質細胞在 sCT 鎮痛中作用機制。方法：72 只雄性 SD 大鼠建立坐骨神經結扎神經病理性疼痛大鼠模型后，隨機分為 6 組 (n = 12)：正常組、CCI 組、sCT 組、射氟代檸檬酸 (FCA) 組、苯甲酸鈉 (SB) 組和 7- 氯犬尿酸 (CK) 組。除正常組及 CCI 組外大鼠均腹腔內 sCT。von Frey 纖維檢測其機械痛閾值 (MWT)，ELISA 法檢測其 PAG 中 D-Ser 水平。結果：建模后大鼠 MWT 下降，給予腹腔注射 sCT 后，D-Ser 水平和 MWT 顯著上升（P 均 < 0.001）；PAG 注射 FCA 或 SB，分別引起 sCT 治療大鼠 D-Ser 水平和 MWT 下降或上升（P 均 < 0.001）；PAG 注射CK 引起 sCT 治療大鼠 MWT 下降（P < 0.001），D-Ser 水平無變化。結論：sCT 引起神經病理性疼痛大鼠 PAG 星形膠質細胞活化，D-Ser 釋放增加，增強 NMDA 受體功能產生鎮痛作用。
關鍵詞 降鈣素；星形膠質細胞；D- 絲氨酸；中腦導水管周圍灰質；神經病理性疼痛既往認為，哺乳動物體內無D-絲氨酸（D-serine，D-Ser）存在。隨后研究發現哺乳動物（大鼠）大腦星形膠質細胞中有 D-Ser 和 D-Ser 消旋酶（serine racemase，SR）存在，且活化的星形膠質細胞可釋放 D-Ser，近年發現除了星形膠質細胞（主要），神經元也可以釋放 D-Ser[1]。合成和降解 D-Ser 的酶分別是 SR 和 D- 氨基酸氧化酶 (D-amino acid oxidase，DAAO)。D-serine 可以作為共激動劑 (co-agonist)，與 N- 甲基 -D- 門冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate，NMDA）的 NR1 亞基的“甘氨酸位點”進行結合，是調節 NMDA 受體活性及神經毒性的關鍵因子，因此膠質細胞通過突觸小泡形式釋放 D-Ser 與 NMDA受體作用實現對神經元功能的調節 [2]。中腦導水管周圍灰質（periaqueductal gray，PAG）接受來自外周的疼痛信息，同時也接受高位中樞的疼痛調制信息，是機體內源性鎮痛系統的關鍵結構，近年發現，PAG 也是機體下行性疼痛易化系統的關鍵結構。興奮性神經遞質谷氨酸 (glutamate, Glu) 及其受體在疼痛調制中作用重大。脊髓和外周，Glu 水平的提高和 / 或 NMDA 受體的活化可產生致痛作用，而在脊髓上結構，Glu 水平的提高和 / 或NMDA 受體的活化可產生鎮痛作用。研究證實：大鼠 PAG 中微量注射 NMDA 產生強大的鎮痛作用，而 NMDA 受體拮抗劑 D-AP7 可減弱此鎮痛作用，說明 PAG 中 NMDA 受體的活化將產生鎮痛作用 [3]。如前所述，D-Ser 是 NMDA 受體甘氨酸位點的激動劑，其激動作用強于 Gly。Martins 研究發現 [4]：PAG 微量注射 Gly 可劑量依賴的提高大鼠甩尾反射閾值，產生鎮痛作用，那么很有可能 PAG 中 D-ser的增多也可以產生鎮痛作用。結合前期研究 [5]：對慢性神經病理性疼痛（CCI 模型）大鼠 PAG 微量注射鮭魚降鈣素 (salmon calcitonin，sCT) 后，CCI 大鼠疼痛行為緩解，機械痛閾 (mechanical withdrawal thresholds，MWT) 和熱痛閾上調，那么 sCT 在 PAG的鎮痛機制是否也包含 D-Ser 的介入呢？本研究將通過腹腔注射 sCT 后，觀察 PAG 中 D-Ser 水平變化以及其變化對 sCT 鎮痛作用的影響。
方 法
1. 材料
（1）動物：雄性清潔級 SD 大鼠 72 只，體質量 210 ～ 220 g，由遵義醫學院實驗動物中心提供，合格證號：SYXK（黔）2011-003。在安靜、溫度 24±2℃、濕度 60%±5%、明暗各 12 h (8AM-8PM) 周期環境中飼養，每籠 4 ～ 5 只。大鼠自由飲食和飲水。隨機分為正常組、CCI 組、sCT 組、氟 代 檸 檬 酸 (fluorocitrate, FCA) 組、7- 氯 犬 尿 酸(7-chlorokynurenate，CK) 組、 苯 甲 酸 鈉 (sodium benzoate，SB) 組，每組 12 只。建模后 14 d，每組大鼠各隨機取 6 只，ELISA 法檢測 PAG 中 D-Ser 水平，余下 6 只繼續觀察機械痛閾變化，直到建模后21 d。sCT 組大鼠從 CCI 手術后 1 d 開始，每日給予 sCT（2 µg/(kg.d)，i.p.），直到手術后 21 d 實驗結束。FCA 組、7-CK 組和苯甲酸鈉組取 CCI 建模并經 sCT 腹腔注射 14 d 大鼠，分別在大鼠 PAG 微量 注 射 FCA (1.2 µg/0.3 µl)、SB (150 µg/0.3 µL) 和7-CK (3.6 µg/0.3 µL)，觀察大鼠機械痛閾以及 D-Ser水平變化。本實驗嚴格按照疼痛學會 (IASP) 關于應用動物進行疼痛研究的倫理綱要進行操作。
（2） 試 劑：sCT（ 美 國 Sigma 公 司）， 溶 于0.001N 醋酸 , 終濃度 1 µg/ml； FCA（美國 Sigma公司）, 溶于生理鹽水，終濃度 4 mg/ml；SB（美國Sigma 公司）溶于生理鹽水，終濃度 500 mg/ml；7-CK（美國 Sigma 公司）溶于含 5% 二甲基亞砜（DMSO）的 PBS 溶液，終濃度 12mg/ml；腦立體定位儀（日本 Narishige 公司）；微量進樣器 (5 µl，寧波鎮海玻璃儀器廠 )；D-serine 酶聯免疫分析試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司）；酶標儀（芬蘭，Labsystems Multiskan MS 352 型）；洗板機（芬蘭Thermo Labsystems，AC8 型）； 電 子 Von Frey 測痛儀（2390 系列，美國 IITC Life Science）
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