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大鼠腫瘤壞死因子 α （ TNF- TNF- TNF- TNF- α ） 酶聯(lián)免疫 分析
試劑 盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
檢測(cè)范圍： 96T 96T 96T 96T
10ng/L-360ng/L
使用目的：
本試劑盒用于測(cè)定 大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中 小鼠腫瘤壞死因子 α （ TNF- α ）
含量 。
實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定 標(biāo)本 中 大鼠腫瘤壞死因子 α （ TNF- α ） 水平。用純化
的 大鼠腫瘤壞死因子 α （ TNF- α ） 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中
依次加入 腫瘤壞死因子 α （ TNF- α ） ， 再與 HRP 標(biāo)記的 腫瘤壞死因子 α （ TNF- α ） 抗體結(jié)
合，形成抗體 - 抗原 - 酶標(biāo)抗體復(fù)合物 ，經(jīng)過*洗滌后 加 底物 TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶
的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色 ， 并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色 。 顏色的深淺和樣品中的 腫瘤壞死
因子 α （ TNF- α ） 呈正相關(guān) 。 用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度 （ OD 值 ） ， 通過標(biāo)準(zhǔn)曲
線 計(jì)算樣品 中 大鼠腫瘤壞死因子 α （ TNF- α ） 濃度。
試劑盒組成
1 30 倍濃縮洗滌液 20ml × 1 瓶 7 終止液 6ml × 1 瓶
2 酶標(biāo)試劑 6ml × 1 瓶 8 標(biāo)準(zhǔn) 品（ 720ng/L ） 0.5ml × 1 瓶
3 酶 標(biāo)包被 板 12 孔 × 8 條 9 標(biāo)準(zhǔn)品 稀釋液 1.5ml × 1 瓶
4 樣品 稀釋液 6ml × 1 瓶 10 說明書 1 份
5 顯色劑 A 液 6ml × 1 瓶 11 封板膜 2 張
6 顯色劑 B 液 6ml × 1/ 瓶 12 密封袋 1 個(gè)
標(biāo)本要求
1 ．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能
馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可 將標(biāo)本放于 -20 ℃ 保存，但 應(yīng) 避免反復(fù)凍融
2 ．不能檢測(cè)含 NaN3 的樣品 ，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（ HRP ）活性。
操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋 ： 本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支 ， 用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀
釋。
360ng/L 5 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150 μ l 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入 150 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
180ng/L 4 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150 μ l 的 5 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
90ng/L 3 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150 μ l 的 4 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
45ng/L 2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150 μ l 的 3 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
22.5ng/L 1 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品 150 μ l 的 2 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入 150 μ l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2. 加樣 ： 分別設(shè)空白孔 （ 空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑 ， 其余各步操作相同 ） 、 標(biāo)準(zhǔn)孔 、
待測(cè)樣品孔 。 在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加 樣 50 μ l ， 待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋 液 40 μ l ，
然后再加待測(cè)樣品 10 μ l （樣品zui終稀釋度為 5 倍 ） 。 加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部 ， 盡
量不觸及孔壁， 輕輕 晃動(dòng) 混勻 。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37 ℃ 溫育 3 0 分鐘 。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體， 甩干 ，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此
重復(fù) 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50 μ l ，空白孔除外 。
7. 溫育：操作同 3 。
8. 洗滌：操作同 5 。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 μ l ，再加入顯色劑 B50 μ l ，輕輕震蕩混勻， 37 ℃ 避光顯 色
15 分鐘 .
10. 終止：每孔加終止 液 50 μ l ，終止反應(yīng) （此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色 ） 。
11. 測(cè)定 ： 以空白空調(diào)零 ， 4 50 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的 吸光 度 （ OD 值 ） 。 測(cè)定應(yīng)在加終止
液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
操作程序總結(jié)：
計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)， OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品 的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度 ； 再乘以 稀釋倍數(shù) ； 或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式 ， 將樣品的 OD 值代入方程式 ， 計(jì)算出樣品濃度 ， 再乘以 稀釋倍數(shù) ，
即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項(xiàng)
1 ．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未
用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2 ． 濃洗滌液 可能 會(huì)有 結(jié)晶 析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶 ，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
3 ．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間
控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4 ． 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線 ， 做復(fù)孔 。 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高 （ 樣本 OD 值
大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD 值 ） ，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測(cè)定 ， 計(jì)
算時(shí)請(qǐng)zui后 乘以 總稀釋倍數(shù)（ × n × 5 ） 。
5 ． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6 ．底物請(qǐng)避光保存。
7 ．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn) .
8 ．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9 ．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。
保存條件及有效期
1 ． 試劑盒保存 ： ； 2-8 ℃ 。
2 ．有效期： 6 個(gè)月