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恒遠告訴大家：關于WB實驗的常見問題以及解決方案（3）
閱讀：2273 發布時間：2012-9-14
上海恒遠生物科技有限公司是一家生物技術企業，主要從事免疫學、分子生物學和常規生化試劑的研發、銷售。并代理銷售Omega、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE等二十多家國外，致力于為廣大高校、科研院所和企事業單位提供*的科研試劑和完善的技術服務，滿足生物化學、分子生物學、細胞生物學、免疫學等生物科技實驗需求。
21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？
答：200kd的蛋白不好做，分離膠用7％，積層膠 3.5％。
22、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？
答：可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。
23、蛋白變性后可以存放多久？
答：－80℃，一兩年沒有問題。zui關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉（也是被酶水解了）。
24、我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應當采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內，但需注意條帶位置。
25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的，是嗎？
解答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應該好一點．
26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關系嗎？
答：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關系，也與顯色時間長短有關。開始摸條件時，為了拿到陽性結果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當然背景也就出來了。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。
27、做組織樣品的western的時候，怎樣處理樣品？
答：必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心）。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。
28、問大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
答：做200kd蛋白的Western Blot時要注意，分離膠選擇>7%的；剝膠時要小心；轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如何分析）。
29、有什么方法可以提高上樣量？
答：a）可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量；b）用5倍的上樣緩沖液來稀釋變性
30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？
答：上樣量要根據實驗的要求來定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關系，盡量多上就行了，但是不要超載。
答：200kd的蛋白不好做，分離膠用7％，積層膠 3.5％。
22、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？
答：可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。
23、蛋白變性后可以存放多久？
答：－80℃，一兩年沒有問題。zui關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉（也是被酶水解了）。
24、我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應當采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內，但需注意條帶位置。
25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的，是嗎？
解答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替應該好一點．
26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關系嗎？
答：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時間都有關系，也與顯色時間長短有關。開始摸條件時，為了拿到陽性結果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當然背景也就出來了。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。
27、做組織樣品的western的時候，怎樣處理樣品？
答：必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心）。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。
28、問大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
答：做200kd蛋白的Western Blot時要注意，分離膠選擇>7%的；剝膠時要小心；轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如何分析）。
29、有什么方法可以提高上樣量？
答：a）可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量；b）用5倍的上樣緩沖液來稀釋變性
30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？
答：上樣量要根據實驗的要求來定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關系，盡量多上就行了，但是不要超載。
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