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慢病毒操作步驟及注意事項
閱讀：1725 發布時間：2013-7-19慢病毒操作步驟：
以六孔板中的1孔為例，每個樣品需要1×106個293T細胞。
1、取1.5ml滅菌EP管，加入1.5μg包裝混合質粒和0.5μg表達質粒以及250μl的無血清培養基。輕柔混勻，室溫孵育5min。
2、取1.5ml滅菌EP管，取9μl 脂質體2000l溶于250μl無血清培養基中。輕柔混勻，室溫孵育5min。
3、將DNA溶液和脂質體溶液輕柔混勻。室溫孵育20min
4、用胰酶消化并記數293T細胞。用含血清的培養基重懸細胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生長培養基，再加入DNA-脂質體復合物。
6、將1ml重懸的293T細胞（1×106個細胞/ml）加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育。
7、移除含有DNA-脂質體復合物的培養基移除，代之以DMEM（含丙酮酸鈉和非必須氨基酸）。
7、轉染后48-72h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C貯存。
包裝出來的慢病毒對NIH/3T3細胞達90%以上感染效率。
慢病毒注意事項
1.在慢病毒感染細胞前，為檢測病毒上清培養液內病毒的活性，并確定病毒與轉染細胞之間的比率，需要確定病毒的滴度。病毒的滴度可以通過轉染Hela細胞，然后使用抗體篩選穩定的細胞轉染株，進行計數和數值統計。
2. 在慢病毒轉染細胞的過程中zui重要的一步是融合，只有一些較小的慢病毒載體才能轉導進細胞，因此，病毒顆粒的吸附是慢病毒轉染的限速步驟。.