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人蛋白磷酸化酶2A（PP2A）的活性濃度怎么測？
閱讀：1333 發(fā)布時間：2022-6-17【預(yù)期用途】
僅供科研使用，本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中蛋白磷酸化酶2A（PP2A）活性。
【檢測原理】
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人蛋白磷酸化酶2A（PP2A）水平。用純化的人蛋白磷酸化酶2A（PP2A）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入蛋白磷酸化酶2A（PP2A），再與HRP標(biāo)記的蛋白磷酸化酶2A（PP2A）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的蛋白磷酸化酶2A（PP2A）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人蛋白磷酸化酶2A（PP2A）活性濃度。
【產(chǎn)品性能】
1、物理性能
試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無破損漏氣(如有漏氣，不影響使用）。
2、劑量反應(yīng)曲線線性
標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900。
3、檢測范圍
1.2U/L -45U/L。
4、靈敏度
檢出劑量不能小于0.3U/L 。
5、精密度
精密度用樣品測定值的變異系數(shù)CV 表示。CV（%） = SD/mean×100
批內(nèi)差：取同批次試劑盒對低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測，每份樣本連續(xù)測定20 次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD 值。
批間差：選取3 個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量測定，每個樣本使用同一試劑盒重復(fù)測定10 次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD 值。
批內(nèi)差： CV<5.9%
批間差： CV<8.1%
6、回收率
分別往5個不同樣本中添加已知濃度的目標(biāo)蛋白，做回收實(shí)驗(yàn)，得出回收率范圍和平均回收率。
7、線性
分別往5個樣本中添加已知濃度的目標(biāo)蛋白，做回收實(shí)驗(yàn)，得出回收率范圍及平均回收率。將5個樣本分別稀釋2倍，4倍，8倍，16倍做回收實(shí)驗(yàn)，得出回收率范圍及平均回收率。
8、特異性
本試劑盒識別天然和重組 人蛋白磷酸化酶2A（PP2A），經(jīng)檢測與其它相似物質(zhì)無明顯交叉反應(yīng)。由于受到技術(shù)及樣本來源的限制，不可能完成所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應(yīng)檢測，因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)。
9、穩(wěn)定性
經(jīng)測定，試劑盒在有效期內(nèi)務(wù)必按推薦溫度保存，活性降低率小于5%。為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來進(jìn)行操作可減少人為誤差。
【操作步驟】
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。
2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
7.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
8.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10-20分鐘。
10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11.測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。