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植物病毒血清學(xué)檢測—酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）:DAS-ELISA
閱讀：8284 發(fā)布時間：2011-11-7酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（Enzyme-Linke Immuno Sorbent Assay; ELISA）是把抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)有機地結(jié)合而發(fā)展起來的，是用酶作為標記物或指示劑，進行抗原或抗體定性 、定量測定的綜合技術(shù)。
與其他植物病毒的血清學(xué)檢測方法相比較，ELISA的突出優(yōu)點在于：1. 靈敏度高，檢測濃度可達 1-10 ng/mL。2. 專化性強、重復(fù)性好。3. 快速、結(jié)果可以在幾個小時內(nèi)得到。4. 檢測對象廣，一般不受抗原形態(tài)的影響。5. 適用于處理大批樣 品。6. 具有自動化及試劑盒的發(fā)展?jié)摿Α?
ELISA 從種類上可歸為“直接”和“間接”兩種。直接法就將抗原吸附在一個固相上，用酶標記特異抗體直接檢測；間接法就是先用沒標記的特異抗體于固相上的抗原結(jié)合，采用標記的“第二抗體”（即抗特異抗體的結(jié)合物） 或 A 蛋白為結(jié)合物測抗原。這兩種方法都是將抗原本身通過靜電吸引結(jié)合在固相上（即抗原包被），或被事先吸附在固相上的特異抗體或抗體片段選擇誘捕。
ELISA實驗有多種方法：直接法（Direct method）；間接法（Indirect method）；雙抗夾心法（Double antibody sandwich method）; 酶標 A 蛋白雙抗夾心法；酶抗酶（Enzyme-anti-enzyme method）；異種動物抗體雙夾心法；青霉素 （Penicillinase）酶系統(tǒng)；生物素（Biotin）- 親和素（Avidin）酶系統(tǒng)等。
一. 目的
ELISA試驗方法是用于檢測植物病毒zui廣泛的血清學(xué)方法之一。之中，的為雙抗體夾心法（DAS ），靈敏度及專化性都令人滿意。在 ELISA中免疫專化性通過相結(jié)合的酶與合適的底物反應(yīng)表現(xiàn)出來。通過本實驗掌握zui典型的雙抗體夾心法的原理及技術(shù)。
二.實驗材料及用具
1.ELISA板，聚苯乙烯（PVC ）板均可用，板孔根據(jù)酶標儀設(shè)計程序采用40孔或96孔。
2.特異性抗體免疫球蛋白IgG或F（ab’）2 。
3.酶標記抗體免疫球蛋白IgG（用HRP或ALP酶標記）。
4.感染病毒的病株及健康植株。
5.微量取液器（40-200 μL可調(diào)，1000uL可調(diào)，20uL可調(diào)）；洗瓶。
6.酶聯(lián)免疫檢測儀,臺式離心機,冰箱。
7.包被緩沖液；洗滌緩沖液；IgG 稀釋緩沖液；底物溶液；鄰苯二胺（OPD）；過氧化氫（H2O2 ）；2M硫酸。
8.10mL、200mL量筒；5mL、10mL、100mL、500mL燒杯；50mL三角瓶；100mL、500mL容量瓶；研缽；記號筆；小塑料袋；2-5mL可調(diào)洗滌瓶。
三.緩沖液的配制
1.磷酸緩沖液：用0.02M PBS（pH=7.4），可以配成0.1M，用時稀釋5倍使用。
2.洗滌緩沖液：用 0.02M PBS 緩沖液（pH=7.4）及 Tween20 配制。PBS－Tween緩沖液＝1000mL PBS+0.5mL Tween20。
3.包被緩沖液：0.05M碳酸鹽緩沖液（pH=9.6） ,4℃保存。
4.酶標抗體稀釋緩沖液：1000mL PBS-T+1％牛血清白蛋白（BSA ）
5.底物溶液：磷酸－檸檬酸緩沖液（pH=5.0）
6.終止液：2-4mol/L H2SO4
四.實驗步驟（用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體IgG步驟）
1.包被抗體：在酶聯(lián)板每孔中加入200 μL適宜濃度特異性抗體免疫球蛋白液（用包被緩沖液稀釋：0.1M pH=9.0碳酸鹽緩沖液）。加蓋以防蒸發(fā)，置 37℃下孵育2-4小時或4℃下過夜。
2.洗滌、封閉：甩凈孔中溶液，用PBS-Tween（0.02M pH=7.4磷酸緩沖液＋Tween-20）沖洗反應(yīng)孔，室溫靜置3-5分鐘后再沖洗，共重復(fù)三次。注意排除氣泡。
3.加待檢的抗原標樣：每孔加200μL待測樣品，同時設(shè)陽性、陰性及空白對照。抗原稀釋液為PBS-T液。加蓋4℃下孵育過夜或37℃ 4-6小時。
4.洗滌：方法同上，重復(fù)三次。
5.酶標記抗體：每孔加入適宜濃度的特異性酶標記抗體 IgG 200 μL,30℃下孵育3-6小時（酶標記抗體稀釋液為PBS-T＋0.1％牛血清白蛋白）。
6.洗滌：方法同上，重復(fù)三次。
7.加底物溶液：加入200 μL新配制的底物液，室溫下孵育0.2-1小時或直至顯色到所需程度。
8. 終止反應(yīng)：用50 μL適當(dāng)?shù)慕K止液終止反應(yīng)。如底物為OPD（ 或TMB），則用2M H2SO4終止。底物為pNPP用3M NaOH終止。
9.觀察結(jié)果：用肉眼觀察顏色反應(yīng)，并以顏色深淺記錄+++，++，+，±，-或用酶聯(lián)檢測儀測定（O.D）吸收值。判斷結(jié)果。