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一氧化氮合酶染色法的具體操作步驟
閱讀：1467 發布時間：2013-7-29一氧化氮合酶染色法的具體操作步驟
一氧化氮合酶（nitrfic oxides synthase，NGS）是一種連接酶，能催化前體物質L精氨酸L瓜氨酸和一氧化氮（NO）。NO是中樞和外周神經系統中的一種神經遞質，活細胞間信使和內皮源性松弛血管的介質，在神經、心血管及免疫系統中有廣泛的作用。NO極不穩定。易于擴散游離，半衰期短，不易檢測。因NOS是合成NO的關鍵酶，故通常通過檢測NOS的活性來評估NO的分布和功能。NOS有3種異構型，即神經型NOS（neuronal NOS，nNOS）、內皮型NOS（endothelial NOS。eNOS）和細胞因子誘導型NOS（inducible NOS，iNOS）。由于還原型輔酶Ⅱ—黃遞酶（NADPH-d）與NOS在化學結構和組織定位上有*的一致性，且也與NO密切相關．故人們常采用NADPH-黃遞酶法來顯示NOS活性。
1．原理 在βNADPH存在下，NOS的C末端能將NADPH電子轉移到NBT，將NBT還原成不溶性藍紫色甲臘沉淀產物。
2．孵育液配制
β—NADPH 10mg
NBT 5mg
Triton X—100 0．03ml
0．05mol/L TB（pH 8．0） 9．97ml
臨用前配制。
3．染色程序
（1）固定：4％多聚甲醛（0．1mol/LPBS配制）灌流固定，取材后入同樣固定液再固定1小時（4℃），20％蔗糖中4℃過一夜；
（2）冰凍切片：厚10—401．Lm；
（3）孵育：切片人孵育液中37％孵育30分鐘～1小時；
（4）終止反應：切片人0．05mol/LTB或蒸餾水中；分鐘；
（5）常規脫水、透明、封片或直接用甘油明膠封片。
4．結果與評價 反應產物為藍色或藍紫色沉淀。NADPH-黃遞酶法顯示NOS活性，方法簡便經濟，應用廣泛，但不能區分NOS亞型。
5．對照實驗 在孵育液中除去β—NADPH或用0．1mol/L N—亞硝基精氨酸（NOS抑制劑）預孵育切片1小時，結果應為陰性。
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