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上海恒遠教您：細胞裂解方法
閱讀：1557 發布時間：2019-3-13
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使用說明：
對于培養細胞樣品：
1. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。
2. 對于貼壁細胞：去除培養液，用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍（如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗）。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2秒后，細胞就會被裂解。
對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。
3. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
裂解液用量說明：通常6孔板每孔細胞加入150微升裂解液已經足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200微升或250微升。
對于組織樣品：
1. 把組織剪切成細小的碎片。
2. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。
3. 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。）
4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
6. 如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續實驗。直接裂解的優點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
注：RIPA裂解液的裂解產物中經常會出現一小團透明膠狀物，屬正常現象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。在不檢測和基因組DNA結合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續實驗；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續實驗。如果檢測一些常見的轉錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉錄因子。