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考馬斯亮藍G－250染色法測定蛋白含量
閱讀：5231 發(fā)布時間：2012-10-26考馬斯亮藍G－250染色法測定蛋白含量
1、實驗目的：掌握考馬斯亮藍G－250染色法測定蛋白含量的原理和方法。
2、實驗內(nèi)容
實驗原理：考馬斯亮藍G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的zui大吸收峰的位置（λmax），由465 nm變?yōu)?/span>595 nm，溶液的顏色由棕黑色變?yōu)樗{色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別色精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595 nm下測得的吸光度A595 nm,與蛋白質(zhì)濃度成正比。
試劑與材料：
1. 標準蛋白質(zhì)溶液
稱取牛血清白蛋白（BSA）10mg，溶于100ml水，配置成100μg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液。
2. 考馬斯亮藍G-250染料試劑
100 mg考馬斯亮藍G-250溶于50 ml95％的乙醇后，再加入120 ml85％的磷酸，用水稀釋至1 L。
3. 材料：豆芽
操作步驟：
1標準曲線的繪制
取試管6支按下表操作，搖勻，2～5 min后比色（595 nm），1管為空白對照管。作吸光度-蛋白濃度曲線。
| 管 號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 1.0 mg/ml標準蛋白質(zhì)（ml） | 0 | 0.20 | 0.40 | 0.60 | 0.20 | 0 |
| 蒸餾水（ml） | 1.00 | 0.80 | 0.60 | 0.40 | 0.80 | 1.00 |
| 考馬斯亮藍G-250染料（ml） | 5 | |||||
2樣品蛋白濃度測定
準確稱取豆芽1.0000g，加入用10mL研磨成勻漿后，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入小燒杯中。
準確吸取樣品上清液1 ml置干凈試管中，加入考馬斯亮藍G-250染料5 ml并搖勻，2～5 min后比色（595 nm）。對照標準曲線求出樣品蛋白濃度。
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