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[ELISA試劑盒]哺乳動物細胞的裂解和提取步驟
閱讀：2931 發布時間：2012-11-22 一細胞的裂解
單層細胞的裂解
懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解
a．單層細胞的裂解
a）吸出培養液，以7ml用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細胞培養皿內的單層細胞，重復1次，將平板置于冰上直至所有單層細胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上，再將鋁板置于冰盤上。
b）直徑為90mm的培養皿需加0.5ml RNA提取緩沖液， 并使之遍布整個平板的表面。
RNA提取緩沖注液
0.14mol/L NaCl
1.5mmol/L MgCl2
10mmol/L Tris.Cl（pH8.6）
0.5％NP-40
1mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）
100單位/ml胎盤RNA酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復合物
c）加0.5ml蛋白酶消化緩沖液，用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。
蛋白酶消化緩沖液
0.2mol/L Tris.Cl（pH8.0）
25mmol/L EDTA（pH8.0）
0.3mol/L NaCl
2％ SDS
d）用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復3－4次，剪切DNA。
c）加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。
蛋白酶K以貯存液的形式保存，貯存液為20mg/ml 蛋白K溶液。
b．懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解
a）于4℃以2000g離心5分鐘收集細胞，以10倍體積用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀，洗滌細胞3次，每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細胞沉淀，使其*分散。
b）估計細胞沉淀的體積，用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。
c）加入與步驟b）所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器迅速混勻。用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復3－4次，剪切DNA。
d）加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存，貯存液為20μg/ml蛋白酶K水溶液。
二提取步驟
1）用等體積酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白質。
2）用吊桶式轉頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相， 將水相吸至一個新的離心管內，加2.5倍體積用冰預次序的乙醇，充分混勻， 于0℃放置1小時。
3）于0℃以5000g離心10分鐘沉淀RNA，棄上清，用含0.1mol/L 乙酸鈉（pH5.2）的70％乙酸洗滌沉淀，用自動微量移液器盡可能將乙醇吸盡， 隨后于室溫放置幾分鐘，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因為干的核酸沉淀很難溶解。
4）每個直徑為90mm的培養皿或每107細胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl（ pH7.8）1mmol/L EDTA（pH8.0）溶液重溶沉淀。
5）分別按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇（DTT），然后分別按1000單位/或10mmol/L 的終深度加臺盤RNA酶抑制劑或氧釩核苷復合物。
6）加入無RNA酶的胰DNA酶I至終濃度為2μg/ml，混勻，于37℃溫育60分鐘。
7）分別按10mmol/L和0.2％的終濃度加EDTA和SDS。
8）用等體積酚：氯仿抽提1次。
9）于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相， 將水相吸至另一個離心管內，加3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L，加2.5倍體積用冰預次的乙醇，充分混勻，冰浴放置2小時。
10）用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘沉淀RNA。
11）吸出所有的乙醇，將打開管蓋的離心管在實驗臺放置幾分鐘，讓zui后殘存的痕量乙醇揮發干凈。
12）用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇，于－70 ℃貯存備用。回收DNA時，只須取出1小份貯存液，加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L，充分混勻，用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。
三注意事項
1．測定zui終所得溶液的OD260值可以確定RNA的濃度。取10μl乙醇/TE混合液[步驟13）]離心沉淀RNA，以400水重溶， 測定OD260 值， OD260＝1的RNA溶液每毫升約含40μg RNA。
2.如果需要，可用oligo（dT） －纖維素層析法從所制備的細胞總RNA中純化無寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA或購買試劑盒進行mRNA的純化。
3.某些情況下（例如從感染了DNA病毒或用DNA轉染的細胞中制備RNA時），必須從細胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則，當用這種RNA構建cDNA庫或進行引物延伸反應時應會出問題， 反轉錄過程中法染的模板DNA 片段可能會與RNA雜交而充當引物，從而導致物定mRNA5'末端定位的錯誤或產生截短的cDNA克隆。
a）步驟12后，加200μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），用自動微量移液器反復吹吸，以重懸核酸沉淀，將懸浮液移至另一個滅菌的微量離心管內。
b）用微量離心機于室溫以12 000g離心10分鐘，RNA沉于管底，而絕大部分寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。
c）棄上清液，用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），分混勻，加入550μl用冰預冷的乙醇。混勻溶液， 在冰上驟冷30分鐘。用微量離心機于4℃以12 000g離主10分鐘，以回收RNA。小心吸出上清。d）棄上清液，用300μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加1ml乙醇，－70℃貯存備用。
回收RNA時，只需取出1小份貯存液，加3mol乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L充分混勻，用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。如需去除氧釩核糖核苷復合物，用含0.1％羥喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl（pH7.8）平衡]將RNA終溶液抽提數次即可。
4. 對大多數細胞株來說， 一個直徑90mm 培養甲中培養的RNA收率為100-200μg
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