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細胞DNA轉染方法
閱讀：2406 發布時間：2013-6-6細胞DNA轉染方法
對于大部分的細胞系， DNA與DNAfect的比例在1:2至1:3時轉染效率較高。為了提高轉化效率、表達水平并且減少細胞毒性，實驗應在細胞密度較大時進行轉染。以下操作以24孔板每孔細胞的DNA轉染操作為例。
1. 貼壁細胞：轉化前一天，在24孔板的每孔中加入500 μl無抗生素的生長培養基，并于每孔中接種0.5-2×105個細胞，待細胞長至80-90%滿時進行轉染。
懸浮細胞：在細胞轉染之前，在24孔板的每孔中加入500 μl無抗生素的生長培養基，并于每孔中接種3-5×105
個細胞。
2. 轉染當天，首先準備轉染復合物，對于每孔細胞按照以下用量配制：
a. 取適量DNA，加入25 μl無血清培養基，并輕輕的混合均勻。
b. 取適量DNAfect，加入25 μl無血清培養基，輕輕混勻，并于室溫孵育5分鐘。
c. 孵育5分鐘之后，將稀釋的DNA和稀釋的DNAfect混合（使DNA以及DNAfectin的終總體積為50 μl），輕輕 混合均勻，并在室溫下孵育20分鐘（溶液可能會出現絮狀，但不會影響轉染效率） 注意：該混合物在室溫下可以穩定保存6小時。
3. 將步驟1中24孔板中培養的細胞生長培養基更換成450 μl無血清培養基，然后將步驟2中50 μl轉染復合物加入到
24細胞孔板內，輕輕前后推動24孔板以混勻。
4. 將細胞置于含5%CO2，37℃條件下培養4-6小時后，更換成500 μl生長培養基。
5. 18-48小時后進行轉染基因表達的檢測。
6. 對于穩定的細胞系：在轉染24小時后，細胞按照1:10的比例傳代，第二天可加入篩選培養基進行篩選。
注：（1） 該說明為一個24孔的用量，若同時轉幾個孔，配制轉染復合物的量需加倍；若轉染其他類型孔板，DNA和DNAfect用量見附表，該附表用量以293T細胞為轉染細胞時的標準用量。
（2） 轉染4-6小時后也可以不更換生長培養基，但由于DNAfect具有一定的細胞毒性，作用時間過長可能使某些細胞出現大量死亡現 象，建議更換生長培養基。
（3） 優化條件：想要得到更高的轉染效率，應優化轉染條件：培養物、DNA濃度、細胞數和細胞與DNA復合物的孵育時間等條件都 應進行優化。