豬4-羥基壬烯酸（4-HNE）ELISA試劑盒使用說明本試劑盒僅供研究使用。檢測范圍： 96T0.5ng/L -22ng/L使用目的：本試劑盒用于測定豬血清、血漿及相關(guān)液體樣本中4-羥基壬烯酸（4-HNE）含量。實驗原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中豬4-羥基壬烯酸（4-HNE）水平。用純化的豬4-羥基壬烯酸（4-HNE）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入4-羥基壬烯酸（4-HNE），再與HRP 標記的4-羥基壬烯酸（4-HNE）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的4-羥基壬烯酸（4-HNE）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中豬4-羥基壬烯酸（4-HNE）濃度。試劑盒組成1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 7 終止液 6ml×1 瓶2 酶標試劑 6ml×1 瓶 8 標準品（40ng/L） 0.5ml×1 瓶3 酶標包被板 12 孔×8 條 9 標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶 10 說明書 1 份5 顯色劑A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 張6 顯色劑B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 個標本要求1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復凍融2．不能檢測含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。20ng/L 5 號標準品 150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液10ng/L 4 號標準品 150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液5ng/L 3 號標準品 150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液2.5ng/L 2 號標準品 150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液1.25ng/L 1 號標準品 150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。7. 溫育：操作同3。8. 洗滌：操作同5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 分鐘.10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進行。操作程序總結(jié)：計算以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。注意事項1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值大于標準品孔*孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．底物請避光保存。7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。9．本試劑不同批號組分不得混用。保存條件及有效期1．試劑盒保存：；2-8℃。2．有效期：6 個月
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