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人抗著絲點抗體（ACA/CENP）ELISA檢測試劑盒說明書
閱讀：240 發布時間：2012-9-4| | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 人抗著絲點抗體（ACA/CENP）ELISA檢測試劑盒 本試劑僅供研究使用 試驗原理： ACA/CENP試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知ACA/CENP濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將ACA/CENP和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中ACA/CENP的活性濃度呈比例關系。 試劑盒內容及其配制
自備材料 1． 蒸餾水。 2． 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。 3． 振蕩器及磁力攪拌器等。 安全性 1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。 2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。 3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。 操作注意事項 1． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。 2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。 3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。 4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。 5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。 6． 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。 7． 底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。 8． 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。 9． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。 樣品收集、處理及保存方法 1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。 2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。 3、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。 4、 保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。 試劑的準備 1． 標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。 操作步驟 1． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。 2． 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。 3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。 4． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。 5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。 6． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。 7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。 8． 取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。 9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。 性能 1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。 2. 特異性：不與人其它細胞因子反應。 3. 重復性：板內、板間變異系數均小于10%。 4.局限性：6號標準品以上的結果為非線性的，根據此標準曲線無法得到的結果。 結果 判 斷與分析 1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值 2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的ACA/CENP標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的ACA/CENP含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。 3、檢測值范圍：0-400ng/ml 4、敏感度： 1.0ng/ml | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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