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熒光western blot應(yīng)注意什么
閱讀：2541 發(fā)布時(shí)間：2012-8-1隨著熒光檢測(cè)的普及，許多研究人員正考慮將western blot的檢測(cè)方法從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)到多重?zé)晒?。這一趨勢(shì)背后有多個(gè)推動(dòng)力。zui重要的是，熒光檢測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)多重western blot分析，每次能夠同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)目標(biāo)蛋白，而不再需要?jiǎng)冸x和重新雜交。熒光的其他好處在于動(dòng)態(tài)范圍更寬、信號(hào)穩(wěn)定性更好。
隨著熒光檢測(cè)的普及，許多研究人員正考慮將western blot的檢測(cè)方法從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)到多重?zé)晒?。這一趨勢(shì)背后有多個(gè)推動(dòng)力。zui重要的是，熒光檢測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)多重western blot分析，每次能夠同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)目標(biāo)蛋白，而不再需要?jiǎng)冸x和重新雜交。熒光的其他好處在于動(dòng)態(tài)范圍更寬、信號(hào)穩(wěn)定性更好。
為了讓這個(gè)轉(zhuǎn)換過(guò)程更加輕松，Bio-Rad的科學(xué)家為我們帶來(lái)了一些熒光western blot的小貼士。
• 抗體濃度應(yīng)當(dāng)優(yōu)化，在幾種不同稀釋度的抗體中孵育膜。選擇信噪比zui高的稀釋度。
• 從化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)到熒光檢測(cè)時(shí)，一抗?jié)舛葢?yīng)當(dāng)增加；通常來(lái)說(shuō)是增加2-5倍。二抗?jié)舛瓤赡芤残枰獌?yōu)化；1:5,000稀釋是個(gè)不錯(cuò)的起點(diǎn)。在使用特定抗體時(shí)，可以參照生產(chǎn)商的建議。生物通 • 為了讓信噪比zui高，應(yīng)使用自發(fā)熒光低的膜，如 Immun-Blot® low fluorescence （LF） PVDF membrane。
• 許多封閉液都成功用于熒光檢測(cè)。我們建議使用0.5-5% 酪蛋白、zui多5%的脫脂奶粉，或zui多3% BSA，溶于TTBS中。• 緩沖液中的顆?？赡芡Ａ粼谀ど?，并造成熒光假象。只使用高質(zhì)量的試劑，并對(duì)所有緩沖液過(guò)濾滅菌。
• 使用鈍的鑷子從邊緣操作。避免劃破膜或弄皺，這會(huì)在熒光檢測(cè)時(shí)造成假象。生物通 • 使用鉛筆來(lái)標(biāo)記膜，因?yàn)樵S多墨水都會(huì)發(fā)出熒光。
• 溴酚藍(lán)會(huì)發(fā)出熒光。確保染料與樣品已分開(kāi)，切掉凝膠上包含染料的部分，或省掉樣品緩沖液中的溴酚藍(lán)。• 無(wú)需在暗處開(kāi)展免疫檢測(cè)；正常的室內(nèi)燈光不會(huì)使熒光標(biāo)記的抗體發(fā)生光漂白。不過(guò)，熒光標(biāo)記抗體的儲(chǔ)液應(yīng)保存在暗處。
• 在處理膜時(shí)，使用無(wú)粉末的手套，以避免膜上出現(xiàn)假象或指紋。
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