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RACE技術的原理
閱讀：3823 發布時間：2011-11-11RACE技術日益完善，目前己有商業化RACE技術產品推出，如CLONTECH的MarathoTM技術和SMARTTM RACE技術。邢桂春等（2001）先后使用上述兩種試劑盒進行RACE反應，結果發現使用MarathonTM所得到的片斷總是比采用SMARTTM RACE試劑盒到所得到的片斷短。其原因在于MarathonTM技術反轉錄反應往往不能真正達到mRNA的5' 末端。所以認為，進行RACE反應應當優選SMARTTM RACE試劑盒。以下就國內目前應用zui廣的SMARTTM RACE試劑盒為例，簡要概述RACE技術的原理和操作過程。
利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個引物結合位點，以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物反轉錄合成標準*鏈cDNA.然后用一個基因特異引物GSP1（gene specific primer，GSP）作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為下游引物，以cDNA*鏈為模板，進行PCR循環，把目的基因3' 末端的DNA片段擴增出來。
SMARTTM 5'-RACE的原理
先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個引物結合位點，以Oligo（dT）30MN作為鎖定引物在反轉錄酶MMLV作用下，反轉錄合成標準*鏈cDNA.利用該反轉錄酶具有的末端轉移酶活性，在反轉錄達到*鏈的5'末端時自動加上3-5個（dC）殘基，退火后（dC）殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接頭引物配對后，轉換為以SMART序列為模板繼續延伸而連上通用接頭（見Figure 2 ）。然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為上游引物，用一個基因特異引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作為下游引物，以SMART*鏈cDNA為模板，進行PCR循環，把目的基因5'末端的cDNA片段擴增出來。zui終，從2個有相互重疊序列的3'/ 5'-RACE產物中獲得全長cDNA，或者通過分析RACE產物的3'和5'端序列，合成相應引物擴增出全長cDNA。
實驗中發現，做RACE反應實驗實際操作中仍存在不少困難。因此，對RACE反應條件進行反復摸索是十分必要的。這是因為：
*，在5'-RACE包含了有3個連續的酶反應步驟（反轉錄、同聚物加尾和PCR擴增），每一步都可能導致失敗；
第二，擴增DNA末端的特異性*依賴錨定引物及擴增DNA模板樣品的不均一性，因而特異性一般很低，常呈現不清晰的成片條帶或截短的產物背景。因此，使用RACE技術擴增得到的特異末端片段，所獲得的重組克隆能夠全部測序，以排除RACE實驗結果中擴增產物假陽性和假陰性，zui終有可能獲得新基因的全序列。
隨著RACE的不斷改進和完善，優化條件下PCR擴增效率和忠實性的提高及PCR產物克隆技術的迅速發展，RACE必將在基因克隆及基因表達研究中發揮越來越大的作用。
RACE的另一種代表方法-Self-Ligation法
1. 反轉錄（RT）反應。
2. Hybrid RNA的分解。
3. 單鏈cDNA的自身連接。
4. PCR擴增5'未知區域。
5. 目的DNA片段的切膠回收。
6. DNA序列測定。
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