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上海恒遠分享 蛋白質分離的操作流程
閱讀：1264 發(fā)布時間：2013-10-14一、選擇材料和預處理
微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質的原材料，所選用的材料主要依據實驗目的來確定。從工業(yè)生產角度考慮，注意選含量高、來源豐富及成本低的原料。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先除去結締組織和脂肪組織。對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應冷凍保存，對于易分解的生物大分子應選用新鮮材料制備。
二、細胞的破碎及細胞器的分離
1、細胞的破碎
（一）機械方法：主要通過機械切力的作用使組織細胞破壞。
高速組織搗碎機（轉速可達10000rpm，具高速轉動的鋒利的刀片），適用于動物內臟組織的破碎。
玻璃勻漿器（用兩個磨砂面相互摩擦，將細胞磨碎），適用于少量材料；也可用不銹鋼或硬質塑料等，兩面間隔只有十分之幾毫米，對細胞破碎程度比高速搗碎機高，機械切力對分子破壞較小。小量的也可用乳缽與適當的緩沖劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細。
（二）物理方法：主要通過各種物理因素的作用，使組織細胞破碎 。
反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
超聲波法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料；只要有設備，該法方便且效果也好，但一次處理量較小。應用超聲波處理時應注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質酶時宜慎重。
（三）化學及生物化學法
有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等使細胞膜破壞；細菌細胞壁較厚，采用溶菌酶處理效果更好。此外一些細胞膜較脆弱的細胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細胞脹破。
2、細胞器的分離
制備某一種生物大分子需要采用細胞中某一部分的材料，或者為了純化某一特定細胞器上的生物大分子，防止其他細胞組分的干擾，細胞破碎后常將細胞內各組分先行分離，以便于獲得更好的分離效果。
細胞器的分離一般采用差速離心法：細胞經過破碎后，在適當介質中進行差速離心。利用細胞各組分質量大小不同，沉降于離心管內不同區(qū)域，分離后即得所需組分。
細胞器的分離制備，介質的選擇現(xiàn)一般用蔗糖、Ficoll或葡萄糖-聚乙二醇等溶液。
三、蛋白質的抽提
提取是將經過預處理或破碎了的細胞或組織置于一定條件下的溶劑中，讓被提取的蛋白質以溶解狀態(tài)充分地釋放出來，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性的過程。大部分蛋白質都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數與脂類結合的蛋白質則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質。
抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。
膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑，使膜結構破壞，利于蛋白質與膜分離。
在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。
1、水溶液提取法
大部分蛋白質均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中，因此蛋白質的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質穩(wěn)定性好、溶度大，也是提取蛋白質的zui常用溶劑。
注意事項：
溫度：一般采用低溫（4℃以下）操作鹽濃度：等滲鹽溶液以0.02～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用；0.15mol/L氯化鈉溶液應用也較多。pH：提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH 范圍
2、有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取；這些有機溶劑具有一定的親水性，還有較強的親脂性，是理想的脂蛋白提取液。
必須在低溫下操作。
丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別*丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強。丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內不會引起酶的變性失活。丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。
3、表面活性劑的利用
對于某些與脂質結合的蛋白質和酶，可以采用表面活性劑如膽酸鹽及十二烷基磺酸鈉等處理。
表面活性劑有陰離子型（如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等），陽離子型（如氧化芐烷基二甲基銨等）及非離子型（Triton X-100 、Tirton X-114、吐溫60及吐溫80）等。非離子型表面活性劑比離子型溫和，不易引起酶失活，使用較多。
4、對提取物的保護
無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使生物大分子降解，導致天然產物的量減少。二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；碘乙酸可以抑制活性中心有巰基的蛋白水解酶的活性苯甲磺酰氟化物（PMSF）能清除蛋白水解酶活力還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使反應條件適合于目的蛋白的提取。