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進口PCR實驗原理及反應要素介紹

時間:2019/4/25閱讀:1296
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聚合酶鏈式反應

一、發展簡史

     聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的特點,是能將微量的DNA大幅增加。因此,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所的毛發、皮膚或血液,只要能分離出一丁點的DNA,就能用PCR加以放大,進行比對。這也是"微量證據"的威力之所在。

    1983年美國Mullis首先提出設想,1985年由其發明了聚合酶鏈反應,即簡易DNA擴增法,意味著PCR技術的真正誕生。

二、實驗原理

    類似于DNA的體內復制。

首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈,隨之將反應混合物冷卻至某一溫度,這一溫度可使引物與它的靶序列發生退火,再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環。

PCR過程是由變性,退火,延伸3個步驟組成的不斷重復的過程。標準的PCR過程分為三步:

1.DNA變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈DN

2.退火(復性)(40℃-65℃):系統溫度降低,引物與DNA模板結合,形成局部雙鏈。

3.3.延伸(68℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右的活性)的作用下,以dNTP為原料,從引物的5′端→3′ 端延伸,合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。

三、PCR反應要素:

  1. DNA模版:可以是雙鏈、單鏈、提取染色體的DNA、克隆的質粒DNA,
  2. 引物:一對寡聚DNA,分別與模板兩側的3’端序列互補,可使DNA序列得到擴增
  3. DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶):催化DNA合成,
  4. 緩沖液:提供DNA合成反應所需的PH,離子強度等環境
  5. 4種單核苷酸:dNTP,提供DNA合成原料
  • 實驗材料

     PCR擴增儀、PCR反應管、PCR離心管、移液器、凝膠電泳設備、冰盒、離心機

模板、PCR引物、TaqDNA聚合酶、dNTP反應緩沖液、Mg2+、ddH2O。

  • PCR反應體系
  1. 以DNA為模板的反應體系:

  模板:DNA102~105拷貝

  引物

  底物:4種dNTP

  TaqDNA聚合酶

  緩沖液

  體積:

  1. 以mRNA為模板的反應(逆轉錄PCR)

  模板:RNA

  引物:oligo(dT)12~18

  底物:4種dNTP

  逆轉錄酶

  緩沖液

  其他試劑:RNA酶抑制劑,MgCl2.DTT.

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