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技術(shù)文章

?PCR的循環(huán)的參數(shù)

閱讀:543          發(fā)布時間:2021-12-16

1.  預(yù)變性(Initial denaturation)

模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關(guān)重要,建議加熱時間參考試劑說明書,一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。


2.  循環(huán)中的變性步驟

循環(huán)中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列*變性,可能的情況下可 縮短該步驟時間,變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不*,易造成擴增失敗。


3.  引物退火(Primer annealing)

退火溫度需要從多方面去決定,一般根據(jù)引物的Tm值為參考,根據(jù)擴增的長度適當下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實驗基礎(chǔ)上做出預(yù)估。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響。


4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃進行(Taq酶最適溫度)。但在擴增長度較短且退火溫度較高時,本步驟可省略

延伸時間隨擴增片段長短而定,一般推薦在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。


5.  循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-40循環(huán),過多易產(chǎn)生非特異擴增。


6.  最后延伸

在最后一個循環(huán)后,反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘.使引物延伸*,并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。


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