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細胞冷凍保存方法?及注意事項
閱讀:283 發布時間:2023-9-11冷凍保存方法:
1、傳統方法: 冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16~18小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。
-20℃不可超過1小時,以防止胞內冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
2、程序降溫:利用已設定程序的等速降溫機以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。
3、步驟:
(1)冷凍前24-48小時更換半量或全量培養基,使細胞處于指數生長期。
(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):另取一離心管,加入培養基、血清,逐滴加入二甲基亞砜(DMSO)至20%濃度,即制成雙倍的凍存液,置于室溫下待用。
(3)離心收集培養之細胞,用加血清的培養基重懸起細胞,取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數細胞濃度及凍前存活率。
(4)取與細胞懸液等量的凍存液,緩慢逐滴加入細胞懸液,并晃動試管,制成細胞凍存懸液(DMSO最后濃度為5~10%),使細胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標示全之冷凍保存管中,1~2ml/vial,并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后,注明細胞名稱、代數、日期。然后進行凍存。
注意事項:
(1)欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態,約為80~90%致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其te有性質,例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
(2)細胞在液氮中可長期凍存無限shi間,而不會影響細胞活力;在-70度可保存數月。
(3)注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級,無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級,以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用,因長期儲存后對細胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液,可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲,可降低細胞受損。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化,可換用10%甘油凍存。
(4)冷凍保存之細胞濃度:
①normal human fibroblast:1~3×106cells/ml
②hybridoma:1~3×106cells/ml,細胞濃度不要太高,某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死qu。
③adherent tumor lines:5~7×106,依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,而HeLa只需1~3×106cells/ml
④other suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
(5)冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO,若是不確定細胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時,亦應作一個backup culture,以防止冷凍失敗。
(6)、凍存可用10%~90%的血清,一般高濃度血清有助于維護細胞活力,此處介紹20%終濃度有利于細胞懸浮而少沉積(4度時),復蘇存活率在80%~90%以上,對原代培養細胞,以90%血清凍存更為有效。