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蛋白質定量分析實驗詳解
閱讀：426 發布時間：2023-9-22蛋白質的定量分析主要依靠蛋白質本身的發色基團，或與其它顯色劑反應產生的紫外吸收來進行的。目前常用的蛋白質的定量主要有紫外線吸收法、Bradford法及BCA法等。
實驗原理：BCA（bicinchoninic acid，二辛可酸）法測定蛋白的原理 二價銅離子在堿性條件下可以被蛋白質還原成一價銅離子（biuret reaction），一價銅離子和du特的BCA溶液A（含有BCA）相互作用產生敏感的顏色反應。兩分子的BCA螯合一個銅離子，形成紫色的反應復合物。該水溶性的復合物在562nm處顯示強烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內有良好的線性關系，并于標準曲線對比，因此根據吸光值可以推算出蛋白濃度。
實驗材料：
1.試劑A 含1%BCA二鈉鹽溶液、2%無水碳酸鈉溶液、0.16%酒石酸鈉溶液、0.4%氫氧化鈉溶液、0.95%碳酸氫鈉溶液，將上述液體混勻后調PH至11.25。
2.試劑B 4%硫酸銅溶液。
3.BCA工作液 按50體積試劑A加1體積試劑B（50：1），配制適量BCA工作液，充分混勻。
4.蛋白質標準液
（1）儲存液配制：準確稱取50mg牛血清白蛋白，溶于10ml蒸餾水或PBS中，即為5mg/ml的蛋白標準液儲存液。
（2）工作液：取儲存液10ul稀釋至100ul，使終濃度為0.5mg/ml。
實驗儀器：
主要儀器酶標儀是分光光度計的另一種形式；光電檢測器將待測標本不同而強弱不同的光信號轉換成相應的電信號，電信號經前置放大、對數放大、模數轉換等信號處理后送入微處理器進行數據處理和計算。
實驗方法：
1、制作標準曲線：參照標準配制蛋白質溶液及蛋白質標準曲線繪制。
2、各孔加入200ul BCA 工作液，37℃培養箱放置15~30min。用酶標儀測定A562nm,根據標準曲線計算出蛋白濃度。使用溫箱孵育時，應注意防止因水分蒸發影響檢測結果。
注意事項：
1、要考慮樣品中可能會干擾蛋白質定量的因素，以此確定合適的蛋白質定量方法。
2、每種蛋白質定量方法都有一定的檢測范圍，因此需要估計蛋白質含量并進行適當的稀釋，以確保蛋白質含量在檢測范圍內，保證定量的準確性。
3、為了保證定量的準確性，應在每次測定時繪制新的標準曲線。因為BCA法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深，并且顯色反應的速度和溫度有關，所以除非精確控制顯色反應的溫度和時間，否則如需精確測定需要每次都繪制標準曲線。
優點:
1、靈敏度高，最小檢測蛋白量可達0.5ug，檢測濃度下限達25ug/ml。
2、速度快，比一般的檢測方法快。且不易受去污劑、尿素等的影響。
3、在20-2000ug/ml濃度范圍內有良好的線性關系。
缺點：
1.未具體說明說明曲線的繪制方法：以牛血清白蛋白含量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。以標準曲線空白為對照，根據樣品的吸光值從標準曲線上查出樣品的蛋白質含量。
2.與熒光蛋白質定量等方法相比，屬于化學呈色法檢測靈敏度不夠。
3.會受螯合劑、高濃度還原劑的影響。