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雙抗夾心ELISA法重點分析
閱讀：73 發布時間：2024-4-16酶聯免疫吸附分析Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA是以體外抗原抗體反應為基礎，將抗原抗體特異性反應與酶的高效催化作用相結合的一種檢測方法，靈敏度可達皮克(pg/mL)水平。
常見的ELISA類型雙抗體夾心法，其基本原理是將定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待檢標本，通過加入檢測抗體，酶標記第二抗體后用TMB底物顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈正相關。
1、包被抗體
許多物質可作為固相載體，如聚丙酰胺和纖維素等，在進行抗體固定化之前，需要對酶標板材進行篩選。酶標板由親水到疏水，對蛋白的結合會由強變弱，造成吸附能力的差異。將抗體吸附在固相載體表面時，要求純度要好，吸附時一般要求pH在9.0～9.6之間。蛋白質包被的最適濃度需進行滴定：用不同的蛋白質濃度包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本OD值，選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。
2、標準品及樣本
標準品即為目標物（樣本中待檢測因子）的純蛋白，從母液稀釋到級聯稀釋都需要特別留意，標曲的制作是ELISA實驗成功的關鍵。待檢目標物需具備多個抗原表位，即二價或二價以上的大分子抗原，因為這種檢測方法需要兩種抗體。另外，需要注意的是血清樣本中的類風濕因子（RF）干擾——RF能與多種動物的變性IgG的Fc部分結合而產生假陽性反應。
3、洗滌液
ELISA操作中會涉及到多次洗板。長時間的孵育后，會出現非特異性結合，這時就需要洗滌液來洗去非特異性結合的蛋白或抗體，通常為PBS，洗4-6次，每次30s左右。多次短時間洗板比少次長時間洗板更有效，在最后一次洗板時，盡量拍凈液體，同時注意讓板子保持濕潤。
4、檢測抗體
雙抗體夾心法中的檢測抗體與目標蛋白結合位點需要有別于目標物與包被抗體結合的位點，即會涉及抗體配對的問題。常用的抗體配對方法有下幾種：
1）、 包被抗體為單抗，檢測抗體為多抗；
2）、包被抗體為單抗，檢測抗體為單抗，但這兩種單抗針對的抗原表位不同；
3）、包被抗體為多抗，檢測抗體為多抗，這兩種多抗一般來源于不同的宿主。
5、生物素標記的二抗
鑒于酶標二抗的局限性，現在廠家一般引入生物素親和素系統(biotin avidin system, BAS)，這種系統在提高反應靈敏度的同時，應用起來也更加方便。進行生物素標記時，可依據抗體所帶可標記基團種類（氨基、醛基、巰基等）以及分子酸堿性選擇相應的活化生物素和反應條件。生物素標記后，不影響被標記物的生物活性。
6、辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素
每個親和素分子可與4個生物素分子結合，所以可以偶合更多連接生物素的酶分子，從而大大提高了ELISA實驗的靈敏度。生物素和親和素間的親和力強，二者一旦結合，就極為穩定，而且這種結合反應時間比抗原抗體反應所需時間短。在BAS檢測中多用鏈霉親和素“streptavidin, SA"，它是鏈霉菌培養過程中的分泌物，由4條相同的肽鏈組成。HRP靈敏，穩定，比活性高，分子量小，純酶容易制備。其有4對半胱氨酸形成的二硫鍵，99位Asp和123位Arg形成的鹽橋，9個潛在的糖基化位點，有兩個金屬中心，可催化顯色底物TMB產生藍色一價物。
7、顯色底物
由于 TMB比其他顯色底物具有更高的靈敏度且無致癌性、故而被廣泛使用。HRP 或其他適當過氧化物酶能在過氧化氫存在下催化TMB生成可溶的藍色物，此時通常可在 370nm 測定吸光度。當顯色反應被酸性溶液終止后，產物由藍色一價物轉為黃色二價物，此時可在 450nm 測定吸光度。